巨细胞病毒感染

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巨细胞包涵体感染是由巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)引起的先天性或后天性感染,有两种类型,多数成为唾液腺的不显性感染或慢性感染而长期存留。另一种是全身性疾病,称巨细胞包涵体病(cytomegalic inclusion disease),比较少见,主要侵犯小婴儿,其特点是在很多器官组织内发现含核内和胞浆内包涵体的巨大细胞,并伴有全身症状,是宫内病毒感染导致胎儿畸形的重要原因之一。 

CMV感染在全世界分布,人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。  

目录

病原体

巨细胞病毒属疱疹病毒群,具有典型的疱疹病毒样结构,是一种大DNA病毒,直径为80-110纳米,病毒壳体为20面对称体,含有162个壳粒。周围有单层或双层的类脂蛋白套膜。它有1个血清型,可分3个以上亚型。它只能在活细胞中生长,一般用人的纤维母细胞培养。它在体外生长缓慢,复制周期为36-48小时。被巨细胞病毒感染的细胞在光学显微镜下检查可见到细胞和核变大,有包涵体形成。核内包涵体周围与核膜间有一轮“晕”,因而称为“猫头鹰眼细胞”,这种细胞具有形态学诊断意义。  

诊断

单靠临床表现不能诊断CMV感染,从临床标本中分离出病毒,同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高,将有助于诊断。  

一、病毒分离

最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离,细胞病变效应(CPE)在1天或数周后出现,经固定和HE染色后可观察到巨细胞,核内有内包涵体,核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体,很象“猫头鹰眼”(owl′s eye)亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。  

二、血清抗体检测

最常用的有补体结合试验(CF)、间接免疫荧光试验(IIF)、免疫酶试验(EIA)、间接血凝试验(IHA)和放射免疫试验(RIA)等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时,应当立即留血清标本,以及间隔2周、4周、8周再留血清标本,结合病毒分离可作原发感染诊断。  

三、DNA探针

已广泛应用于检测CMV,其中以32P标记的探针敏感性最高,对某些标本来说,杂交方法可能比病毒分离更敏感。  

四、聚合酶链式反应(PCR)

(一)标本的采集及处理

采集的标本包括患者的血液、尿,以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层(buffy coats)可保存于-80℃;尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。

尿液标本经2500r/min离心10min,以除去细胞碎片,收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂,因此需用聚乙二醇(PEG6000)进行预处理:50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合,置冰浴中6h;15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min;尽可能吸去上清,将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增;扩增时应于100℃加热10min,迅速置冰浴中冷却。

(二)模板DNA的制备

1.由血液标本制备模板DNA

方法A:向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L;取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。

方法B:由血沉棕黄层(BCP)制备:① 用PBS洗涤BCP两次,收取沉淀。② 加入500μl 6mol/L盐酸胍,匀浆。③ 加入30μl 10mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K(10mg/ml),混合均匀,60℃反应1h。④ 加入1130μl 的乙醇,-20℃沉淀1~2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗两次,最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA中。置4℃备用。

2.由冰冻组织标本制备模板DNA:① 用恒冷切片机切取一块~10μm冰冻组织块,置于1.5ml塑料管中。② 加入10%用缓冲液配制的福马林。③ 10min后离心1~2min轻轻倾去上清液,沉淀用乙醇洗2次。④ 于室温干燥10~60min。⑤ 加入抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K),使刚好浸没沉淀物(约50~100μl );将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥ 37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧ 离心收集上清,取1~10μl 即可进行PCR扩增。

3.由尿液标本制备模板DNA:①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍,7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉悬液(DNA PREP,Asahi Glass Co,Tokyo)混合。② 室温放置10min后,6400r/min离心2min,收集沉淀。③ 沉淀用50%乙醇,10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次,6400r/min离心1min。④ 同样洗涤沉淀2次,收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸馏水,于55℃作用15min。⑥ 15000r/min离心2min,收集上清(含HCMV DNA),进行PCR扩增,将此悬液于100℃加热10min,并迅速于冰浴中冷却。

(三)引物及探针

引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。

(四)PCR扩增步骤

1.10×反应缓冲液:100mmol/L Tris-HCl、pH8.4,500mmol/L KCl,25mmol/L MgCl2,2mg/ml明胶

Taq DNA 聚合酶:5U/μl 。

10×dNTP:4种dNTP各2.0mmol/L。

引物:100pmol/L。

2.常规PCR扩增

10×反应混合物(50μl)反应缓冲液 5μl

10×dNTP 5μl

模板DNA 5μl

Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)

引物 各0.5μl

蒸馏水 3.8μl

加1~2滴矿物油。

将反应混合物于94℃加热5min;然后于95℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 60s,扩增35~40循环。

3.套式(nested)PCR扩增:①反应混合物的组成同(2),仅引物为IE2a和IE4b(包括了整个外显子3,共721b),各100pmol。于94℃ 60s,52℃150s,72℃ 480s,扩增20循环。② 取2μl 上述扩增产物,各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后,于94℃ 60s,52℃150s,72℃180s,扩增20循环。  

(五)产物鉴定

扩增产物的分析可采用固相(滤膜)杂交和液相杂交试验。

1. 固相杂交:

① 预杂交液为3×SSPE,5×Denhardt,0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30~60min。② 加入标记探针(10cpm/μg,2ng/ml),杂交30~60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④ 自显影。

2. 液相杂交及电泳分析:

① 取1/10体积的扩增产物与0.5~1.0pmol末端记的探针混合。② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl,10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液,使总体积为20μl 。③ 95℃ 10min,然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液,于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。⑤ 电泳毕,用溴化乙锭染色,然后对X线片曝光,自显影。

HCMV DNA分子很大,其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性,但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增,可鉴定90%的HCMV野型分离株;而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对,则可检测几乎所有的病毒株。因此,可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。

在HCMV模板DNA制备过程中,有时会产生一些小片段DNA,在PCR反应时常导致一定水平的本底产物,从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法,其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步:首先利用一对引物,扩增包括靶DNA在内的长片段DNA;然后取少量的扩增产物,利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数,即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。

PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1~5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物,可从尿液标本中检测到1pgHCMV DNA序列的水平;利用该系统,在4×104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出,较斑点印迹杂交提高2×103倍。

PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值,因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状血清学证据的出现,可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播,而且受感染的新生儿死亡率较高,因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施,对优生优育也有重要意义。利用这种方法,还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为HCMV与许多严重病症的关系。再者,PCR检测指标稳定,还可进行半定量分析,因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的手段。  

治疗措施

巨细胞病毒感染的治疗,可应用各种抗病毒制剂如GCV、抗巨细胞病毒的免疫球蛋白制剂、干扰素转移因子等。但这些药物并不能解决根本问题,往往停药后病毒又潜伏地回升,鉴于此种病毒可能作为艾滋病的病因之一,各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近,美国学者研制出两种活疫苗,初试后颇见效。一种是由AD169菌株研制成的;另一种是从TOWn菌株制成的,经非肠道给药后,已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能,CMV抗体升高,导致免疫功能增强。  

病原学

CMV属于疱疹病毒群,是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒,其形最大由162个壳粒(capsomer),正20面体构成。有典型的疱疹病毒结构。CMV只能在人纤维母细胞培养中增殖,而不能在其他动物细胞中生长,增殖非常缓慢,初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞;细胞变园,膨胀,细胞及核巨大化,核周围出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。

CMV在20%乙醚中最多存活2小时。pH<5时,或置于56℃30分钟,或紫外线照射5分钟可被充分灭活。CMV的感染性对冻融或存于-20℃或-50℃均不稳定,10%的家用漂白粉可使其感染性明显降低。  

发病机理

CMV感染可引起机体的免疫功能降低,特别是细胞免疫功能下降。CMV感染对胸腺发育及脾细胞单核吞噬细胞、NK细胞及CTL细胞的功能有着显著的影响。  

一、对胸腺、脾脏的影响

实验室急性CMV感染的新生豚鼠,胸腺发育受抑,T细胞数减少,成年鼠感染CMV后,88%胸腺可检出CMV。

CMV感染致脾功能受影响,脾脏淋巴细胞对conA刺激的增殖下降,脾细胞产生的IL-2显著降低。  

二、对免疫细胞的影响

CMV感染引起的免疫抑制与病毒在细胞内的复制有关。CMV可以在单核吞噬细胞、T细胞、B细胞及一些尚未确定的单核细胞中复制,其中单核吞噬细胞最易感染CMV,淋巴细胞在免疫反应中具有重要的调节功能和效应功能。CMV感染后,可引起淋巴细胞的多种免疫功能受损。

CMV感染多表现为急性单核细胞增多症。外周血淋巴细胞对有丝分裂原、CMV抗原和HSV抗原增殖反应减弱,诱导干扰素水平下降,CD4/CD8比值从1.7±0.7下降为0.2+0.2,T细胞活性降低.这种变化有的可持续相当长时间,病后10个月,大多数患者T细胞亚群比例仍未完全恢复正常。

CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大单核细胞和CD8细胞的功能异常所致。单核吞噬细胞在抗CMV免疫中起着枢纽作用,不但可以直接吞噬、杀伤病毒,更重要的是可以处理、提呈抗原,分泌细胞因子,调控和扩大免疫反应。当CMV感染后,单核吞噬细胞功能受到影响,CMV感染巨噬细胞引起其吞噬功能降低,细胞内氧自由基产生减少,FC受体补体受体的表达发生改变,且其抗原提呈功能降低,产生IL-1降低,对IL-1及IL-2的反应亦降低。Moses等用胸腺细胞增殖试验检测,IL-1活性降低,IL-1产生降低可引起TH/TS细胞比例失衡。

NK细胞有拮抗CMV扩散的作用。NK细胞积极参与了抗CMV感染的全过程,但存在高的NK活力不一定是保护性应答,而是活动性感染的证明。NK细胞虽不能阻止原发性CMV感染的出现,但一旦存在感染后,NK细胞能在CMV感染早期出现,有限制扩散、使感染局限的作用。NK细胞、CTL细胞是抗CMV的重要效应细胞。在CMV复制早期,感染性病毒体产生前,它们能裂解感染细胞,使病毒在细胞间扩散流产。在小鼠模型中,病毒作用了3-5天时,抗病毒效应由NK细胞介导,NK细胞活性可由IFN增强。6-21天,脾、外周血存在CTL细胞的杀伤活性。NK细胞、CTL细胞活性的高低决定了机体对CMV感染的敏感性及感染恢复的难易性。但CMV感染时,NK细胞及CTL细胞活性亦受到严重影响。此外,特异性细胞免疫有阻止CMV感染再发作用。有人检测了20个发生CMV感染肾移植受者T细胞应答,发现有14个有CMV细胞毒应答,而6个不出现细胞毒应答者有严重的临床后果。因此,特异性T细胞存在,有阻止CMV感染再发的作用。  

三、抗体有降低CMV感染的毒力作用

机体受CMV的感染后,可出现多种抗体。乳汁、宫颈分泌物、唾液中尽管有特异性抗体出现,包括中和抗体。但仍能检出CMV,说明抗体并不能阻止病毒扩散。胎儿从母体被动获得的抗体不能阻断经宫内、产道或乳汁传播的感染。研究证明,致死性CMV攻击前,在小鼠腹腔或静脉注入0.2ml高效价抗CMV球蛋白,可完全保护动物免于死亡。1个月后再用CMV等二次攻击,动物仍全部存活,表明抗体有降低CMV的毒力作用。

初次感染后,CMV将在宿主细胞中无限期存在成潜伏状态。可能累及多种组织器官,尸检提示肺、肝、胰、唾液腺中枢神经系统及肠也可能是病毒潜伏场所。先天性感染的严重程度,与缺乏产生沉淀抗体的能力和T细胞对CMV的应答有关。儿童和成年人感染CMV后,在外周血中出现具有抑制细胞表型活化T淋巴细胞,如果宿主的T细胞功能受损,潜伏的病毒就可能复活并引起多种症候群。组织移植后发生的慢性刺激,为CMV活化,诱发疾病提供了条件。某些针对T细胞的强烈免疫抑制剂抗胸腺细胞球蛋白,与临床CMV症候群高发率有关。此外,CMV在功能上可作为辅助因子,使潜伏感染的HIV活化。  

流行病学

CMV感染在全世界分布,人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。如因器官移植而接受免疫抑制剂治疗者,常因所供器官和输入血液中有潜伏病毒,或免疫抑制使潜伏的病毒活化而发病,艾滋病患者的CMV感染发病率高。

传染源是病人及其急性带毒者,病毒可由乳汁、唾液及尿排出,可持续数周到几年,人类易于感染,传播途径多种多样。属于性传播性疾病。多从精液,宫颈分泌物,泪液及粪便(口腔性欲,吻肛)感染所致。

同源性CMV感染是输血和器官移植的一种严重危害,多次输血或一次大量输血使原发和再发感染的危险性增高,输入含白细胞血液的危险性更高,器官或骨髓移植术后CMV感染率也高。  

临床表现

CMV感染的自然史很复杂,在原发性感染以后排毒,往往持续数周、数月甚至数年,然后感染转为潜伏。常有复发感染伴重新排毒。甚至在原发感染后很多年,潜伏病毒再激活,也可能有不同抗原性病毒株的再感染。CMV感染的临床表现与个体免疫功能和年龄有关。不论从垂直感染、平行传播或医源性感染所出现的症状与体征都是多种多样的。

关于后天性CMV感染症,在临床中常见于输血后的单核细胞增多症,由于免疫功能缺陷而发生血管网膜炎肺炎以及消化道感染。并且大多数患者合并格-巴氏综合征。  

巨细胞病毒感染传染源

传染源是患者和无症状的隐性感染者。他们可长期或间歇地自唾液、精液、尿液、乳液和子宫颈分泌物中排出病毒。如果与有巨细胞病毒感染的异性性交,而恰好此人此时处于排毒期,则可能被感染。如果孕妇在性生活时染上病毒,则可引起胎儿感染和围产期感染。据统计,由原发性巨细胞病毒感染的孕妇所造成的新生儿的感染率可高达23%,而围产期感染比宫内感染的百分率更高。有人报道约13%的母亲的初乳和乳汁中有病毒排出。此外,输血也常发生巨细胞病毒感染,感染的发生率与输血的数量呈正比,尤其是当血清阳性的供血者给血清阴性的受血者输血时,其感染的危险性最高。此外,长期接受免疫抑制剂治疗的肾移植者中,有90%在尿中可查到病毒,或抗体明显增高。艾滋病患者比正常人更易遭受病毒感染,或使原潜伏在体内的病毒复活。

参考

健康问答网关于巨细胞病毒感染的相关提问

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