沙门氏菌

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伤寒沙门氏菌

沙门氏菌(Salmonella)沙门氏菌病病原体。属肠杆菌科,革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的近一千种(或菌株)。按其抗原成分,可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒杆菌,乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌,丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌,丁组的伤寒杆菌肠炎杆菌等。除伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌和副伤寒乙杆菌引起人类的疾病外,大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病,但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒。  

目录

沙门氏菌基本介绍

沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一,其病原沙门氏菌属肠道细菌科,包括那些引起食物中毒,导致胃肠炎伤寒和副伤寒细菌。它们除可感染人外,还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态,也可表现为有临床症状的致死疾,

鼠伤寒沙门氏菌

它可能加重病态或死亡率,或者降低动物的繁殖生产力。

蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介,感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况,受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例,要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理,以使大多数食物不含沙门氏菌,从而有效预防沙门氏菌病。为此,人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中,作出了不懈的努力,现将有关进展报告如下,并介绍两种快速检测沙门氏菌的试剂盒。  

沙门氏菌抗原构造与分类

o抗原

脂多糖,性质稳定。能耐100℃达数小时,不被乙醇或0.1%石炭酸破坏。决定o型原特异性的是脂多糖中的多糖侧链部分,以1、2、3等阿拉伯数字表示。例如乙型副伤寒杆菌有4、5、12三个。鼠伤寒杆菌有1、4、5、12四个;猪霍乱杆菌有6、7二个。其中有些o抗原是几种菌所共有,如4、5为乙型副伤寒杆菌和鼠伤寒杆菌共有,将具有共同o抗原沙门氏菌归为一组,这样可将沙门杆氏菌属分为a~z、o51~o63、o65~o67共有42组。我国已发现26个菌组、161个血清型。使人类致病的沙门氏杆菌大多属于a~e组。o抗原刺激机体主要产生lgm抗体

h抗原

蛋白质,对热不稳定,60℃经15分钟或乙醇处理被破坏。具有鞭毛的细菌经甲醇液固定后,其o抗原全部被h抗原遮盖,而不能与相应抗o抗体反应。h抗原的特异性取决于多肽链上氨基酸的排列顺序和空间构型

沙门氏杆菌的h抗原有两种,称为第1相和第2相。第1相特异性高,又称特异相,用a、b、c等表示,第2相特异性低,为数种沙门氏杆菌所共有,也称非特异相,用1、2、3等表示。具有第1相和第2相h抗原的细菌称为双相菌,仅有一相者称单相菌。每一组沙门氏杆菌根据h抗原不同,可进一步分种或型。h抗原刺激机体主要产生lgg抗体。

vi抗原

因与毒力有关而命名为vi抗原。由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸组成。不稳定,经60℃加热、石碳酸处理或人工传代培养易破坏或丢失。新从患者标本中分离出的伤寒杆菌、丙型副伤寒杆菌等有此抗原。vi抗原存在于细菌表面,可阻止o抗原与其相应抗体的反应。vi抗原的抗原性弱。当体内菌存在时可产生一定量抗体;细菌被清除后,抗体也随之消失。故测定vi抗体有助于对伤寒带菌者的检出。

沙门氏菌感染细胞机制

沙门氏菌在感染细胞时采取严格的“三步走”战略。首先,在自己的表面形成一个针状突起,以此建立和目标细胞之间的接触,然后,一些专门的蛋白质会通过这个突起抵达目标细胞,破坏目标细胞的细胞膜,打出一个“洞”,最后,沙门氏菌细胞通过这个“洞口”向目标细胞释放真正具有毒性的蛋白质。  

伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌

两种生物如果在生物分类上被归入一个种,想必是非常亲近的了。伤寒沙门氏菌Salmonella Typhi和鼠伤寒沙门氏菌Salmonella Typhimurium这两个名字,看起来也够像的。不过,它们的行为大不相同,基因序列也没有那么像。

鼠伤寒沙门氏菌

伤寒沙门氏菌只感染人类,损害肝、脾和骨髓,每年导致1600万人生病,60万人死掉,由于越来越多菌株具有抗药性,情况可能变得更糟。鼠伤寒沙门氏菌对生活环境不那么挑剔,几乎可感染一切地上走的或爬的活物,在人类身上造成的症状一般是食物中毒(爱吃生鸡蛋的人小心),听起来好像没有伤寒那么可怕,但一些科学家认为它的威胁更大,由此造成的食物中毒事件实际发生数目比报告数目可能多出30倍,每年有上亿人感染,死亡人数比伤寒沙门氏菌多出一倍,主要是婴幼儿和老人。

剑桥SANGER中心——还是这个中心,连项目的领导者也跟上面的鼠疫杆菌是同一人——从越南弄来了一种能够抵抗多种抗生素的伤寒沙门氏菌菌株。测序发现,它的基因组里有200多个假基因, 它们一度起过作用,但在病菌适应人体生活环境的过程中被抛弃了——而这也可能把它逼上了进化的死角。科学家希望,这种单一的口味会使它比较容易对付,只要阻断它感染人类的途径,就有希望根除这种疾病。在此之前,根据基因组也可以设计出更好的疫苗和诊断方法。由于伤寒的症与疟疾登革热等病相似,很容易搞混。  

危害及影响

夏天正是新鲜蔬果抢闸上市的时节,而在大洋彼岸的美国,这个夏天却有不少人因生吃西红柿被“绊倒”了——据最近统计,目前,美国已有30个州几百人因生食了从墨西哥进口的带有沙门氏菌的新鲜西红柿而中毒,患者中至少48人因病情严重住院,其中1人死亡,而“生食疗法”被视为一种健康的时尚,如今听说生吃蔬果也会中毒,不少人十分着急:到底该如何预防?对此,专家指出,并不是所有的蔬果都越鲜吃越好,其实生吃蔬果有不少讲究,有些菜凉拌前一定要用开水焯一下,彻底除尘去虫更卫生。

疫情:美国人生吃西红柿“中毒”

西红柿中含有沙门氏菌

生吃西红柿等新鲜的时蔬水果是再平常不过的事了,然而,在美国中西部和南部30个州,近日却有数百人因生食了从超市或是餐馆购买的新鲜西红柿而出现发烧腹泻腹痛等症状,这些西红柿进口自墨西哥。有几十人因病情严重需住院,甚至已有重症病人死亡。美国疾控中心通过检验发现,吃过这些西红柿的患者检查中都发现了沙门氏菌,看来,这是一起严重的沙门氏菌病疫情。

沙门氏菌是美国食物中毒致死的主要原因。美国人对这种病菌一点都不陌生,每年全国大约报告40000例沙门氏菌感染病例。但实际的感染人数可能要达20倍以上,因为许多轻型病人可能未确诊,据不完全统计,每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染。但是,以前各州爆发的疫情几乎都与人们吃了染上沙门氏菌的肉类、蛋类、乳类有关,但迄今为止,很少听说吃蔬果大面积受沙门氏菌污染甚至在人群中引发大疫情的。对此,周福生教授解释说,这可能是西红柿在生长的过程中,由于空气中紫外线不够强烈,植物在灌溉过程或因土壤中含有沙门氏菌,这样才使西红柿的表皮上沾染了沙门氏菌,加上不少人有生食西红柿的习惯,如果没有清洗干净,就完全有可能发生沙门氏菌感染。不光是食用西红柿,其他瓜果蔬菜也一样。

美国SIDNEY KIMMEL癌症中心的科学家对鼠伤寒沙门氏菌进行测序,发现它的假基因比伤寒沙门氏菌少得多,只有40多个。此外,两种病菌还各自拥有几百个对方所不具备的基因。对于同属一种的两种生物来说,这种差异足够让人惊诧。已知的肠道沙门氏菌有2000种之多,有几种已经在测序中,届时大家彼此对照起来看,就更有意思了。  

沙门氏菌检测方法

自19世纪后期,沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来,检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间,用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一,通常,沙门氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多;第二,食品本身的性质会干扰病原的检测,例如,某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平,从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定;第三,与临床病料不同的是,经过加工的食品,由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用,其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品分析家来说有很大影响,因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难,人们建立了一种简单的微生物增殖步骤,专门针对以食品为传播载体的病原。虽然这些方法本身证明是可靠的,但却很费力、耗时,需要4~7天才能完成。因此,在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时,通常不被采用。随着DNA和抗体技术的发展,近10~15年间发展了无数改进的方法,其中许多可以在48h内检出沙门氏菌,这些方法通称为快速检测。

1、传统的培养方法

用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌,以增加病原的可检出率,这种培养方法总体可分4个不同阶段或步骤。第一步(预增菌),将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中,温度37℃,使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。虽然缓冲胨水被建议常规使用(由于其可保持溶液pH值稳定),但对培养基的选择仍存有争论。第二,是选择性增菌步骤,它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少,与预增菌培养基相似,对选择性培养基的选择,也存在许多不同的观点。目前应用的主要有如下3种类型:连四硫基盐肉汤(Tetrathionatebroth)、硒酸盐胱氨酸肉汤(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培养基。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型,所以,较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤,即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养,然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认,并对该菌落分离物进行一系列生化血清学检测,以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4~7天,才能得出明确的诊断结果。

2、以抗体为基础的检测方法

利用抗原-抗体反应的显著特异性,来进行细菌的鉴别和血清学定型,已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛抗原特异性抗体的存在,使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种,大致可分为以酶标抗体(ELISA),荧光抗体染色(免疫荧光法),同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础,利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体,概括地说,是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原,经洗涤除去未结合的成分,加入第二种酶标抗体,此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上,第二次洗涤后加入酶作用基质,并令其与颜色成分反应,然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化,并促成其自动化。

黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelletest1)对进出口动物产品(鱼粉肉骨粉等)进行沙门氏菌检测。该法采用预先包被了沙门氏菌(A-E群)单克隆抗体的微量板,加入经增菌处理的样品,反应后再加入一定的指示剂,作用毕后用酶标仪测定OD值来判定结果。食物样品经适当的增菌处理,也可用此法进行沙门氏菌检测。ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105~106个细胞/ml,因此,要得出可靠的结果,食物样品首先必需进行预增菌、选择性增菌,通常还要在含有D-甘露糖的肉汤(M肉汤)中进行后增菌,以促进鞭毛发育。总的来说,标准的ELISA法样品的制备,约需要经过40~48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)样品制备过程分步,共耗时24h:①选用营养肉汤进行预增菌(6h),使“致伤”、冷冻的沙门氏菌复苏。②使用选择性培养基RV进行增菌(14h),使沙门氏菌大量繁殖,同时抑制其它杂菌生长。③使用营养肉汤(蛋白胨水)进行后增菌(4h),使沙门氏菌的数量大大增加。比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法本身,则仅需要大约2h而已(其中30min是操作时间,90min是孵育时间)。相比之下,黎兆滚等人的方法可在27h内完成,比上述方法缩短了一半的时间,颇值得推广应用。最新式的沙门氏菌免疫学检测法,利用经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基础。几滴样品加到卡片上,结果可以直接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作,且由于无需要特殊设备,很适合小型实验室使用。尽管卡片检测法与ELISA法一样需要对样品进行增菌处理,但它(卡片法)本身通常需时不超过10min,如果采用黎兆滚等人的样品制备法,则可使操作时间更为缩短。

3、以核酸为基础的方法

细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。由于所有的细胞都含有这种分子,可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列,它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似,探针也需要加附适当的标记,如放射性同位素、酶或发光的标识物。Fitts等人在食品沙门氏菌检测中引入了第一代DNA—RNA杂交技术,此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段,其敏感性高,经大约48h的增菌步骤后,检测极限可达108个细菌/ml,但由于要使用放射性同位素,只能在专门的实验室应用,此方法的优点都被抵消了。为此,以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA(rRNA)—核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分,每个细菌细胞中存在5000~20000个复制体,而相比之下染色体DNA复制体仅2~10个。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能,同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。其另一优点是由于rRNA为单链(而DNA为双链),杂交前无需经过变性步骤。要得到阳性结果,此法需要105个靶细胞/ml,因此对沙门氏菌检测来说,需要进行预增菌和选择性增菌,总共约50h。rRNA探针法比沙门氏菌ELISA法(酶联免疫检测法)更耗时,但二者成本相近。食品细菌检测法的最新进展是在化学扩增体系方面的发展,即聚合酶链反应(PCR),用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增,以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。用于检测沙门氏菌和其它以食物为载体的病原的PCR方法业已建立,其中一些方法显示了极好的敏感性。但该法较难自动化,且必需经选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分。一个完整的以PCR为基础的方法,需要2天才能完成,很大程度上抵销了其高敏感性的优点,但这种方法对那些含沙门氏菌较少或沙门氏菌“致伤”严重难以复苏而仍保有沙门氏菌rRNA的样品尤其有效。

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