单克隆抗体

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抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多抗原决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞(浆细胞)和记忆B细胞,大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体。  

目录

单克隆抗体技术的基本原理

要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞,但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖,应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群,可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

单克隆抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体,对应于多克隆抗体/多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。

单克隆抗体技术过程简图

单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞产生的,这种融合细胞即具有瘤细胞不断分裂的能力,又具有免疫细胞能产生抗体的能力。融合后的杂交细胞(杂种瘤)可以产生大量相同的抗体。当其应用于医疗中时,在识别抗原中的显示的微小变化(如果有的话)有助于减小副作用

1975年,德国科学家乔治.克勒和阿根廷科学家凯撤.米尔斯坦,把产生抗体的B淋巴细胞与多发性骨髓瘤细胞进行融合,形成杂交瘤细胞。这种细胞兼有两个亲代细胞的特征,既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力,又有B淋巴细胞产生抗体的功能。因此,这种杂交瘤细胞就能在细胞培养中产生大量单一类型的高纯度抗体。这种抗体叫“单克隆抗体”。

单抗隆抗体的制备

杂交瘤细胞的大量繁殖

克隆化的细胞可以在体外进行大量培养,收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限,其不能超过特定的细胞浓度,且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠(无胸腺的裸鼠),杂交瘤细胞就开始无限地繁殖,直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。

利用免疫抑制剂,如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等,可以加速和促进肿瘤的生长。

1.材料

  1. 高压灭菌的降植烷。
  2. Balb/c鼠:5~8周龄。
  3. 杂交瘤细胞:取对数生长期的细胞。
  4. RPMI—1640培养液
  5. 新生牛血清

2.操作方法

  1. 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,注射后1~9周内种植细胞。
  2. 收取对数生长期的杂交瘤细胞,用5%FCS—1640液洗涤一次,1 000r/min离心10min。
  3. 取样,用台盼兰染色,计活细胞数,重新用5%FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。
  4. 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞,每只腹腔注射1ml(含1.0×107个细胞/ml)。
  5. 接种后10天左右时间肿瘤体积最大,此时可由腹腔抽取腹水,每隔1~3天取1次,可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。

单克隆抗体的提纯

1.材料

  1. 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液,20 mMol/L NaCl
  2. 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液,40mMol/L NaCl
  3. 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液,80 mMol/L NaCl
  4. 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
  5. 饱和硫酸铵液
  6. DEAE—纤维素柱

2.操作方法

  1. 小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后,于1.00×105转离心30min,去沉淀。
  2. 在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使溶液最终为50%硫酸铵浓度。
  3. 此溶液置冰中30min~60min,然后5 000r/min离心10min,去上清。
  4. 将沉淀溶于Tris-HCl缓冲液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混浊)。
  5. 装入透析袋于Tris-HCl缓冲液(20 mMol/L NaCl)中透析除盐。
  6. 离心去沉淀。
  7. 溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后,于280nm测蛋白含量,估计蛋白质含量. 1A 280unit=0.8mg蛋白质。一般每ml腹水中,含有总蛋白约25mg~36mg。
  8. 过DEAE—纤维素柱:纤维素柱高40cm,以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min,以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱,也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。

测OD280nm收集蛋白峰,单克隆IgG保存备用。

杂交瘤产生各种免疫球蛋白,但主要是IgG和IgM,究竟是哪种为主,则决定于抗原的免疫程序。免疫一次,且3天后就取脾,多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。

单克隆抗体的鉴定

  1. 杂交瘤细胞染色体的检查 采用秋水仙素裂解法进行。
  2. 单克隆抗体的类型、亚型的测定:购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清,采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。
  3. 单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法,如免疫荧光法ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等,同时还需做免疫阻断试验等。
  4. 单抗的效价测定 可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应,腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查,腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。
  5. 必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。  

医学用途

把单克隆抗体与抗癌药物毒素结合起来,就成为威力强大的抗体“生物导弹”。把这种抗体“导弹”注射到癌症患者的血液中,它就会发挥导弹样的作用,在患者体内追踪并附着于癌细胞上,然后与抗体结合的抗癌药物或毒素杀伤和破坏癌细胞,而且很少损伤正常组织细胞。这种抗体“导弹”具有高度选择性,对癌细胞命中率高,杀伤力强的优点,没有一般化学药物那样不分好坏细胞,格杀勿论的缺点。美国约翰.霍普金斯医院应用抗体“导弹”治疗晚期肝癌病人,收到惊人效果。肝脏显著缩小,生存期延长,而且没有副作用。单克隆抗体技术的发明,是免疫学中的一次革命,打破了过去只能在身体内产生抗体的方法,而成功地在体外用细胞培养的方法产生抗体,同时繁殖快,可以产生在体内达不到的高滴度和高专一性的水平。它来自于每一个细胞,所以非常纯净。

单克隆抗体在疾病的诊断和治疗预防方面,与常规的抗体相比,特异性强,灵敏度高,优越性非常明显,可利用此特性制成“生物导弹”用来运送药物至病害部位,主要是癌细胞。在生物导弹中,能识别抗原的单克隆抗体充当瞄准镜,将抗癌药物(弹头)传送到癌细胞,从而使抗癌药物发挥药效。

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