培养基

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培养基(Medium)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含

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有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。

培养基由于配制的原料不同,使用要求不同,而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后,易被细菌污染或分解变质,因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基(如组织培养基),较长时间的贮存,必须放在2~6℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管,现在均改制成粉末。  

目录

按对培养基成分的了解情况分类

  

天然培养基

指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。  

组合培养基

又称为合成培养基或综合培养基,是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。  

半组合培养基

指一类主要以化学试剂配制,同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如,马铃薯蔗糖培养基。  

按培养基外观的物理状态进行分类

液体培养基

一类呈液态的培养基。

液体培养基

  

固体培养基

一类外观呈固态的培养基。根据性质又分为固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基、滤膜。  

半固体培养基

指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态的培养基。  

脱水培养基

又称预制干燥培养基,指含有除水分外的一切成分的商品培养基。  

按培养基对微生物的功能作分类

选择性培养基:一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基,具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能,广泛用于菌种筛选等领域。

鉴别培养基:一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂,从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。例如,伊红美蓝乳糖培养基(EMB)。  

常见培养基

细菌培养

牛肉膏琼脂培养基

牛肉膏0.3g ,蛋白胨1.0g,氯化钠 0.5g,琼脂 1.5g, 水 100ml

在烧杯内加水100毫升,放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠,用蜡笔在烧杯外作上记号后,放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后,加入琼脂,不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水,用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2~7.6,分装在各个试管里,加棉花塞,用高压蒸汽灭菌30分钟。

马铃薯培养基

取新鲜牛心(除去脂肪和血管)250克,用刀细细剁成肉末后,加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在

细菌培养基

烧杯上做好记号,煮沸,转用文火炖2小时。过滤,滤出的肉末干燥处理,滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心,灭菌,备用。

根瘤菌培养基

葡萄糖 10g 磷酸氢二钾 0.5g 碳酸钙 3g 硫酸镁 0.2g 酵母粉 0.4g 琼脂 20g 水 1000ml 1%结晶紫溶液 1ml

先把琼脂加水煮沸溶解,然后分别加入其他组分,搅拌使溶解后,分装,灭菌,备用。  

放线菌培养基

淀粉硝酸盐培养基(高氏一号培养基)

可溶性淀粉 2.0g 硝酸钾 0.1g 磷酸氢二钾 0.05g 氯化钠 0.05g 硫酸镁 0.05g 硫酸亚铁 0.001g 琼脂 2g 水100ml

先把淀粉放在烧杯里,用5毫升水调成糊状后,倒入95毫升水,搅匀后加入其他药品,使它溶解。在烧杯外做好记号,加热到煮沸时加入琼脂,不停搅拌,待琼脂完全溶解后,补足失水。调整pH值到7.2~7.4,分装后灭菌,备用。

面粉琼脂培养基

面粉 60g 琼脂 20g 水1000ml

把面粉用水调成糊状,加水到500ml,放在文火上煮30分钟。另取500ml水,放入琼脂,加热煮沸到溶解后,把两液调匀,补充水分,调整pH值到7.4,分装,灭菌,备用。  

微藻培养基

BG-11培养基

NaNO3 1.5g K2HPO4 . 3H2O 0.04g MgSO4.7H2O 0.075g CaCl2 .2H2O 0.036g Citric Acid (柠檬酸 )0.006g Ferric ammonium citrate(柠檬酸铁铵) 0.006g EDTA (dinatrium-salt) 0.001g Na2CO3 0.02g A5 + Co solution * (A5溶液1000×)1ml Distilled Water (蒸馏水)919ml

SE培养基

NaNO3 0.25g
K2HPO4 . 3H2O 0.075g
MgSO4 . 7H2O 0.075g
CaCl2 . 2H2O 0.025g
KH2PO4 0.175g
NaCl 0.025
Soil extract 40ml
FeCl3.6H2O 0.005
Fe—EDTA 1ml
A5 solution 1000× 1ml
distilled water 958ml

Soil Extract(土壤提取液)配置方法

取花园土未施过肥0。5kg置于烧杯或三角瓶中,加入蒸馏水1000毫升,瓶口用透气塞封口,在水浴中沸水加热2小时,冷却数小时,在无菌条件下过滤,取上清液,将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1000毫升。土壤提取液保存在4ºC备用。

Composition of the A5 solution

Add to 100 ml of distilled water:

H3BO3 286 mg
MnCl2 . 4H2O 181 mg
ZnSO4 . 7H2O 22 mg
CuSO4 . 5 H2O 7.9 mg
(NH4)6Mo7O24 .4H2O 3.9 mg

EDTA-Fe的配置方法:

将EDTA和FeCl3.6H2O分别溶于水和HCl(0.1N),混匀即可。

Na2EDTA 1g
distilled water 50ml
FeCl3.6H2O 81 mg
HCl(0.1N) 50ml

Pr培养基

Preparation: to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar, and the following stock solutions:

working solution g/1000 mL H2O
NaNO3 0.25
CaCl2. 2H2O 0.025
MgSO4. 7H2O 0.075
K2HPO4 0.075
KH2PO4 0.175
NaCl 0.025
A5 solution 1ml
EDTA-Fe 1ml
FeCl3 (0.05%) 1ml

A5溶液和EDTA-Fe溶液配制方法同上。  

真菌培养基

萨市(Sabouraud’s)培养基

蛋白胨 10g 琼脂 20g 麦芽糖 40g 水1000ml

先把蛋白胨、琼脂加水后,加热,不断搅拌,待琼脂溶解后,加入40g麦芽糖(或葡萄糖),搅拌,使它溶解,然后分装,灭菌,备用。

本培养菌是培养许多种类真菌所常用的。

马铃薯糖琼脂培养基

把马铃薯洗净去皮,取200g切成小块,加水1000ml,煮沸半小时后,补足水分。在滤液中加入10g琼脂,煮沸溶解后加糖20g(用于培养霉菌的加入蔗糖,用于培养酵母菌的加入葡萄糖),补足水分,分装,灭菌,备用。

把这培养基的pH值调到7.2~7.4,配方中的糖,如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌

豆芽汁培养基

黄豆芽 100g 琼脂15 g 葡萄糖 20g 水1000ml

洗净黄豆芽,加水煮沸30分钟。用纱布过滤,滤液中加入琼脂,加热溶解后放入糖,搅拌使它溶解,补足水分到1000ml,分装,灭菌,备用。

把这培养基的pH值调到7.2~7.4,可用来培养细菌和放线菌。

豌豆琼脂培养基

豌豆 80粒 琼脂 5g 水 200ml

取80粒干豌豆加水,煮沸1小时,用纱布过滤后,在滤液中加入琼脂,煮沸到溶解,分装,灭菌,备用。

琼脂

  

食用菌菌种培养基

马铃薯-蔗糖-琼脂培养基

20%马铃薯煮汁 1000ml 蔗糖 20g 琼脂 18g

把马铃薯洗净去皮后,切成小块。称取马铃薯小块200g,加水1000ml,煮沸20分钟后,过滤。在滤汁中补足水分到1000ml,即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖,煮沸,使它溶解后,补足水分,分装,灭菌,备用。使用该培养基对pH值要求不严格,可以不测定。

综合马铃薯培养基

20%马铃薯煮汁 1000 ml 磷酸二氢钾 3g 硫酸镁 1.5g 葡萄糖 20g 维生素 10mg 琼脂 18g

先配制20%马铃薯煮汁,方法同上。在煮汁中加入上述各种组分,加热溶解后补足水分,调整pH值到6。分装,灭菌,备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。  

烟草的培养基

在植物组织培养时,通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽.CTK/IAA高时,愈伤组织分化芽

CTK/IAA低时,分化根;CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化

愈伤组织诱导培养基制备

以MS培养基母液为基础,向洁净铝锅中顺序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ,维生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培养基后,再加入0.5mg.L-1的BA8mL,0.5mg.L-1的NAA8mL.然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5mol.L-1的NaOH和0.5 mol.L-1的HCl调整pH值至5.8-6.0.加入14g琼脂,将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积2L,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中.

烟草叶片愈伤组织诱导

烟草

取一无菌培养皿,用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片,然后将其接种于准备好的培养基上,每瓶接种5小片,一共接种6瓶.接种后的三角置于24条件下黑暗培养1周,然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养3周直至愈伤组织形成(两种情况各置3瓶).观察愈伤组织诱导结果,统计愈伤组织诱导率.

器官分化及植株再生培养

将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照,温度20-22 C条件下培养3周,统计愈伤组织再生植株情况.

愈伤组织诱导的总体情况

烟草愈伤组织诱导培养4周后,愈伤组织基本形成,即排除因生长时间不够而未形成愈伤的情况.具体情况见表一中所示,6瓶培养物均有愈伤形成,且都未发生污染,但诱导率几乎各不相同.其中, 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为60.0℅, 在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%.由于实验过程中,外植体即烟草叶片取得偏小,接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡,使整个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小.  

动物细胞培养基

RPMI1640培养基是一个全营养型培养基,广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞的培养,如人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞以及B细胞和T细胞。最初设计用于悬浮细胞培养和人白血病细胞的单层细胞培养。  

特殊培养基

选择性培养基

酵母菌富集培养基

葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05% 孟加拉红0.003% pH4.5

Ashby无氮培养基

富集好养自生固氮菌

甘露醇1% 磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02% 二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5%  

鉴别培养基

EMB培养基

常用于鉴别E.coli

蛋白胨 10g 乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氢二钾2g 伊红Y 0.4g 美蓝0.065g 蒸馏水1000g pH7.2

2216E培养基配方

分离海洋微生物的培养基配方

蛋白胨 5g 酵母膏 1g 磷酸高铁 0.01g 琼脂 15~20g 陈海水 1000ml 煮沸氢氧化钠(5%)的溶液调PH值7.6~7.8  

天然细胞培养基——血清

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。

血清种类

目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体补体等对细胞有害的成分最少。

血清的主要成分

血清样本

血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。

血清主要作用

1. 提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。

2. 提供激素和各种生长因子:胰岛素肾上腺皮质激素氢化可的松地塞米松)、类固醇激素雌二醇睾酮孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子表皮生长因子血小板生长因子等。

3. 提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

4. 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

5. 对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。

血清培养基主要问题

1. 血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难。

2. 血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制。

3. 对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清,因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。

4. 血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡

5. 动物个体不同,血清产地、批号不同,每批质量差异甚大,其成分不能保持一致。

6. 取材中可能带入支原体病毒,对细胞产生潜在影响,可能导致实验失败或实验结果不可靠性。

7. 大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。

血清的质量标准

血清质量高低取决于两方面因素:一是取材对象,二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内,取材过程应严格按照操作规程执行,制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求:

1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。

2. 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

3. 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

4. 血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌。

5. 无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细菌噬菌体污染。

6. 对细胞有良好的支持繁殖作用。

我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体细菌内毒素支持细胞增殖检查。

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