基因诊断与性病/生殖器疱疹

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基因诊断与性传播疾病

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生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus ,HSV)I型、Ⅱ型所致性病之一。近年来发病率明显升高。在国内它还属性病中新一代成员,人们对它的危害性没有足够的认识。单纯疱疹病毒可引起皮肤、粘膜及多种器官感染。它可以通过性接触感染而发生生殖器疱疹(Genital herpes)。生殖器疱疹病毒有两个血清型;HSV-I和HSV-Ⅱ。大多数生殖器疱疹由HSV-Ⅱ引起,本病可呈慢性复发过程,目前尚未有根治的良药。目前HSv 成为不少国家和地区生殖器溃疡的首要病因,同时还和宫颈癌的发病及新生儿疱疹病的传染有关。

目录

第一节 病因学

单纯疱疹病毒属于病毒科,直径180nm,是较大的DNA病毒。它可以分为HSV-1和HSV-2两个亚型,它们在生物学、自然属性以及人类对它们的免疫方面存在着不同。但这两个亚型感染引起的病理生理却相同。HSV的核酸结构为双股线状DNA,每股DNA分长、短两个部分。分子量约为100×106道尔顿,15万硷基对,可编码60个以上的基因产物。在DNA病毒中,单纯疱疹病毒基因结构具有特殊性,因为它的两个独立的核苷酸序列两侧有倒置的重复序列,这两个核苷酸序列能够互相倒置联系,病毒DNA有四种异构体。HSV-1和HSV-2的病毒基因有50%左右的同源性

HSV病毒形态呈球形,病毒核衣壳表面是由162个壳微粒组成的对称20面体(100-110nm),其内是由DNA组成的核心,蛋白质外壳包绕着病毒基因组,外面有一层脂膜。在衣壳和包膜之间是一种多蛋白组成的被膜。HSV有三类基因,分别为α、β和γ基因。HSV感染神经细胞但不造成细胞死亡,病毒在感染细胞内处于抑制状态,被感染细胞的存活与功能也不受影响,把这一过程称为潜伏。病毒基因激活后病毒开始复制,有时可形成疱疹性损害,这一过程称为复发。潜伏感染神经元细胞核内有大量的两种RNA转录体,它们与称作ICP-O的直接早期(α)基因产物重叠,这些RNA转录体按“反义”方向编码,表示它们可能是β和γ蛋白转录的抑制因子,当病毒处于潜伏状态时,其复活能力也被降低,对病毒潜伏的分子机理的了解可能有助于为预防HSV复发找到新途径。

第二节 基因结构

一、基因组结构

HSV-2基因组为双链线性DNA分子,碱基组成含69%G+C,分子量为96×106D。根据基因组两个通过共价键相连的分别被称为L(长)和S(短)的组分的方位不同,HSV-2DNA可有四种异构体。L组分包括82%的病毒DNA,并且有一独特序列“U”,其两侧有一反转重复区域ab或b′a′,分别含6%病毒DNA。S组分占18%的病毒DNA,也有一独特序列(US),其两侧亦有反转重复序列a′c′和ca。a′c′和ca分别含4.3%DNA。彼此相关的L和S序列的倒置衍生于位点特异性重组,重组是由末端“a”序列区的病毒基因产物介导的。HSV-2DNA两端可连接成环状,此结构与病毒的致癌与潜伏有关。HSV-2DNA中L和S的末端重复序列主要编码特定的即刻早期转录产物,而独特序列主要编码特定的早期及晚期多肽糖蛋白

HSV-2有三类基因,即α、β、γ。其中α基因在感染中最早表达且不需要前病毒蛋白的合成;β基因的感染需要α蛋白的预先合成;γ基因的表达需要病毒DNA的复制。现已证实HSVmRNA可合成三类基本蛋白:急早期(immediate early,α)、早期(early,β)和晚期(late,γ)蛋白,β蛋白在DNA复制中起作用,包括胸苷激酶,DNA多聚酶及大多数DNA结合蛋白,而大部分糖蛋白则多为γ蛋白。HSV-2蛋白合成呈连锁调节,即α基因产物诱导β基因表达,而β基因产物(加上一种α蛋白ICOP4)反过来又可终止α基因表达,同时诱导γ基因的表达,γ基因产物则可负调节β基因的表达并且可作为下一轮病毒复制合成α蛋白的起始信号。

迄今为止,已有6个编码糖蛋白的基因已定位于HSV-2线性位点上,其基因产物分别被命名为gB、gC、gD、gE、gG和gH,编码gB、gC的基因位于UL区,而编码gD、gE、gG和gH的US区。

二、与诱导细胞转化有关的基因定位

Aurelian对所有实验中HSV-2感染的细胞株(包括肿癌细胞株)作了分析,发现病毒DNA共有的序列仅两处,一处是Bg1ⅡG片段,位于0.21-0.33图单位,该DNA序列与感染细胞在低血清培养剂中的增殖有关,而与病毒致癌无关;另一处是Bg1ⅡC片段,位于0.45~0.58图单位,能诱导细胞转化.HSV-2诱导仓鼠胚胎成纤维细胞转化的DNA区域位于Bg1Ⅱ/Hpal-CD片段,相当于0.44~0.52图单位.HSV-2DNA的Bb1ⅡN片段位于0.58~0.63图单位,为形态学转化区,已知0.58~0.628中无特定的编码功能.L+K-细胞株或3T3tk-细胞株能通过HSV-2感染转化成TK+表型,导致转化所需的HSV-2DNA序列位于0.28-0.32图单位。

第三节 流行病学

目前生殖器疱疹的流行情况在STD中非常引人注意,它已成为欧美最常见的性病之一。如英国自1971年的4000例增至1985年的20000例。在美国,1966-1984年已增加了15倍。估计美国人群累计病例超过3000万。本病占STD中第5位(7.7%

第四节 免疫学

患者机体对感染HSV的反应如何将直接影响机体是否发病及感染的严重程度、潜伏感染的发展和维持及HSV复发频率。如患者有细胞免疫缺陷和体液免疫缺陷的HSV感染病情较为严重,说明抗体介导和细胞介导的免疫反应对HSV患者十分重要。动物实验证明,T淋巴细胞,NK细胞和巨噬细胞在防止HSV扩散中起主要作用,抗体则有助于减低神经组织中病毒的含量。

在一定的条件下,特异性HSV多克隆抗体,HSV单克隆抗体,已接触HSV抗原的淋巴细胞及针对病毒抗原克隆的T细胞都具有保护不患神经系统疾病神经节潜伏感染。宿主的免疫反应在HSV发病机理方面可能也起一定的作用,HSV抗原的细胞免疫反应涉及多种细胞,如自然杀伤细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞亚群和由这些细胞产生的淋巴因子。给动物被动输入已接触过HSV抗原的淋巴细胞,再用病毒攻击,动物可得到保护而不发病。最大保护作用需激活多种T细胞亚群

通过对疱疹病损研究表明,CD8T淋巴细胞参与感染的控制,新生儿感染HSV时,其γ-干扰素的表达就显著延缓。干扰素可能有直接的抗病毒效应或者可能激活其他非特异性效应细胞

原发感染时,用放射免疫测定法和抗体依赖细胞毒试验,在症状出现4天可检测到HSv IgG抗体。而不依赖补体中和抗体和CF抗体通常要在症状出现后2-3周才测到。感染早期可测到HSV特异性IgM,IgM持续8周,但在潜伏感染及无症状感染者中则测不到IgM。一般情况下,无症状感染者和将复发疱疹者的HSv IgG、IgM或IgA抗体滴度无差异。

最近IgG亚型抗体的检测,对IgG在生殖器疱疹的初感染、再发等也可检出,而IgG2、3、4,在初感染中却不能检出。另外,有人报道有意思的是IgG4,女性比男性呈高频率的检出,但也有人追试这一测试却得到不同结果。还有由Westernblot法可大量检出。HSV的特异性蛋白质抗体,含有5-6种的糖蛋白,含免疫源性的蛋白,HSV-1就有23种,HSV-Ⅱ,也有10-15种,但对此类蛋白的抗体在临床上尚无明确意义。

生殖器疱疹复发感染与抗体水平高低无关。在原发感染后,有高滴度Ne抗体的患者反比低滴度者更易复发。敏感的放射免疫测定法证实,病毒再激活时偶尔IgG、IgM和IgA抗体升高,在唇疱疹和生殖器疱疹病人,其HSv IgM抗体出现也不规则,故血清IgM抗体出现或滴度升高不是复发或无症状再激活的可靠判断指标。

第五节 发病机理

HSV主要经过皮肤、粘膜或破损处进入人体内,首先在表皮真皮细胞内复制。不论有无临床症状,病毒在局部充分复制后感染感觉神经自主神经未稍。病毒沿神经轴索进入神经节内的神经细胞中。动物实验发现,从皮肤粘膜接种HSV到神经节内的神经细胞发现病毒,大约2天时间,可见其感染速度相当快。

HSV-1通常由呼吸道消化道及皮肤粘膜密切接触感染。所以HSV-1常潜伏在三叉神经根和颈上神经节内。故临床所见主要是颜面部位的疱疹,HSV-2主要因性行为传播,生殖器接触而感染,所以HSV-2则常潜伏在骶神经节内,故临床主要表现为生殖器疱疹。患者血清学均为阳性,可终生有泌尿生殖道HSV间歇性活动。

感染最初阶段,病毒先在神经节及与之相接触的神经组织内复制,然后通过感觉神经到达其未稍而使与之相关的皮肤、粘膜表面发生皮损。病毒从外周感觉神经扩散到皮肤、粘膜,这一情况,可以解释表皮大面积受感染和远离原发部位新病损发生的原因。原发性HSV感染病人常有这些特点,而且从远离接种部位的神经组织中发现病毒。初次发病临床症状消退后,在神经内不再分离到感染性病毒。在细胞表面也检不出病毒蛋白。各种刺激因素,如免疫抑制、劳累、感染、精神创伤以及皮肤神经节创伤等都可引起病毒复活。

原发感染缓解后,神经节中找不到感染的病毒和病毒结构蛋白,潜伏感染神经细胞中的病毒基因组和显性感染不同,前者HSV的DNA是环状的,在潜伏感染的小鼠神经细胞核内和人的三叉神经节中检出的RNA转录物中可与编码早期基因ICPO的区域杂交,此RNA是编码ICPO的DNA互补链转录来的。此“反义”RNA可能参与维持神经内潜伏感染但不参与建立潜伏感染,维持潜伏感染的机制不清楚,似乎潜伏感染的细胞仅有HSV蛋白质的部分转录。

第六节 临床表现

一、症状

HSV感染是一种全身性疾病,病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破损皮肤进入人体,可潜于人体正常粘膜、血液唾液以及局部感觉神经节和多数器官内,几乎所有的内脏和粘膜表皮内都可分离到HSV。

原发感染多为隐性,大多无临床症状或呈亚临床表现,仅有少数(约1-10%)可以出现临床症状。主要见于免疫功能低下婴幼儿或严重营养不良或有其它感染的儿童,成人罕见。原发感染消退后,病毒可持续潜居体内。正常人中约有半数以上为本病毒的携带者,可通过口、鼻分泌物而成为传染源,由于HSV在人体中不产生永久免疫力,故每当机体抗病能力减退时,如患某种发热性传染病,胃肠功能紊乱月经妊娠、病灶感染、过度疲劳、情绪环境改变时,体内潜伏的HSV即被激发而发病。

HSV-1主要引起口唇疱疹咽炎角膜结膜炎散发性脑炎,而HSV-2感染主要引起生殖器疱疹,但在临床上也有相反情况。

HSV感染的潜伏期为1-45天,平均为6天,HSV-1感染主要发生于口角、唇缘鼻孔等皮肤粘膜交界处,亦可见颜面或口唇,开始局部先有灼痒及轻度紧张感,偶有伴发神经痛。随即出现红斑,在红斑基础上发生簇集性小丘疹,迅速变为粟粒至绿豆大小的水疱,内容澄清,水疱破裂后出现糜烂面,数日后干燥结痂。自觉灼痒,偶有倦怠,不适和轻微发热等全身症状,愈合可遗留暂时性色素沉着。全病程1-2周左右。

HSV-2感染主要发生于生殖器部位,患部先有烧灼感,很快在红斑的基础上发生成群的小水疱,多见男性包皮、龟头、冠状沟阴茎等处,偶见于尿道;女性常见于阴唇、阴蒂阴道、宫颈等处。水疱可逐渐变成脓疱,约6天左右破溃而形成糜烂或浅的溃疡,自觉疼痛。病人可发生尿道炎,出现排尿困难。多数人有腹股沟淋巴结肿大疼痛,有的病人可出现发热、肌肉痛脑膜炎症状。如发于女性宫颈者可形成溃疡坏死阴道分泌物增多,可有下腹痛。应注意有无宫颈癌发生。孕期患生殖器疱疹时易致流产早产死胎,并易使新生儿感染,发生新生儿单纯疱疹。本病一般经过3周左右可以痊愈,但常有反复发作,一般原发疹后1-4个月内复发,症状较原发者轻,范围亦小,局限于生殖器部位,有时仅有1-2个疱疹,病程亦短,自发病至愈合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染,如口唇、臂部及中枢神经系统等。

二、体征

皮损为红斑基础上可见成群的水疱或脓疱或成糜烂及溃疡。女性患者约90%伴有HSV宫颈炎,宫颈可见发红、糜烂、溃疡,有脓性阴道分泌物。有的患者可有腹股沟淋巴结肿大压痛体温升高。皮肤病变也可出现在口唇、手指、臀部、大腿、手臂,甚至眼部与咽喉。并发脑膜炎或横贯性脊髓炎,一般于发疹后3-12天出现颈项强直颅内压增高的现象。

三、潜伏感染和复发

HSV感染人体后1周左右,血中出现中和抗体,3-4周达高峰,可持续多年,这些抗体能清除病毒和使机体康复,但大多数个体不能彻底消灭病毒,也不能阻止复发,病毒以潜伏状态长期存在宿主体内。不同亚型HSV感染者急性首发生殖器疱疹的临床过程相似,但生殖器病变复发率不同,首发HSV-2感染者约90%,在12个月内会出现一次复发(平均复发4次),而初次感染HSV-1者仅50%出现类似复发(平均复发次数小于1)。不同个体及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的复发率变化很大,大多数年复发5-9次,一般在原发疱疹消退后1-4个月内发生,有些患者受到促发因素,如发热、月经、日晒、寒冷、某些病毒感染等的影响而复发,其特点是每次复发往往发生在同一部位,复发前可有前驱症状如局部瘙痒,发疹前数小时感染部位有灼烧,麻刺感。

复发生殖器疱疹(GH)对患者心理影响较大,由于目前尚无预防复发的有效疗法及可能有诱发生殖器恶变的危险性,故给患者带来心理影响,患者多有抑郁、恐惧等心理障碍,这又直接影响HSV的复发。我们的治疗经验,只要患者坚持规律治疗,都能治愈。

四、HSV与HIV感染:

HSV常与HIV-1同时感染,并能促进病情发展,引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素,能激活HIV复制,Heng对6例AIDS合并生殖系统HSV皮肤损害患者进行皮肤活检,发现角化细胞和巨噬细胞均有HIV-1和HSV-1杂交后使HIV-1保留其感染性,而无需与CD4分子结合即能进入细胞内。此外HSV-1能刺激潜伏型HIV-1,而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在组织中的复制。

第七节 组织病理

表皮细胞发生气球样变性,其中可见有嗜酸性包涵体。表皮开始为网状变性形成的多房性水疱,以后聚合为单房性水疱。真皮乳头层有轻度水肿,有轻重不等炎性细胞浸润。反应严重时可有严重血管炎表现。

第八节 诊断

HSV感染的诊断要依据病史、临床表现和实验室检查结果而定。有不洁性交史,而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱,易复发等不难诊断。必要时可作疱液涂片,培养、接种、免疫荧光检查血清免疫抗体测定等,均有助于诊断和确定病毒类型。

一、细胞学方法

对皮损刮片做Wright-Gemsa (Tzanck试验)或Papanicolaou染色,可检出HSV感染特征的巨细胞包函体,但不能区别HSV感染或水痘带状疱疹病毒感染,敏感性仅为病毒分离的60%。

二、培养法

从水疱底部取材做组织培养分离病毒,为目前较敏感、最特异的检查方法,需5-10天,因其技术条件要求高,价格昂贵,不能普遍使用。

三、抗体检测

目前最广泛的是HSV-2抗体检测,如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体,具有敏感性,且能区分HSV-1和HSV-2的优点。

四、基因诊断

(一)用PCR分型检测单纯疱疹病毒

PCR是一种敏感性高,特异性强的快速检测方法,标本中含有1fg HSV-DNA就可以检出,其在HSV感染的诊断研究中发展较快,且分型检测HSV是发展的趋势。

1、标本采集和处理

(1)标本采集

脑脊液:直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检.如肉眼可见血色,应离心取上清。

羊水婴儿血清: 同上,应避免溶血.

③脑组织: 脑组织尸检、活检标本,加1ml PBS标本缓冲液研磨后,待检。

④眼及皮肤病灶分泌物:用预测(半干)棉拭子直接取患处分泌物,置1ml PBS标本缓冲液中送检。

⑤生殖器(宫颈、阴道、外阴、阴茎)标本:先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢,再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物,置1ml PBS标本缓冲液中送检。

(2)标本处理

预处理:所有液体标本均可直接进行模板制备;可以取100μl标本液,离心5000r/ min×5min后,去上清,取沉淀物进行模板制备。

②模板制备:a: 蛋白酶K消化裂解法:沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,55℃1h后,煮沸10 min,离心5000 r/ min×5min,收集上清。 b:水煮法:沉淀物加100μl蒸馏水,摇均水煮20 min,离心5000 r/ min×5min收集上清。c:1%Triton X-100裂解法:取采集的标本液100μl,加入1μl Triton X-100,水煮20 min,5000 r/ min×5min,收集上清。d: 5%NP-40裂解法:取采集的标本液100μl,加5μl NP-40,水煮20 min ,5000r/ min×5min收集上清。e:如标本溶血严重经上述裂解处理后,再加等体积酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA,加10μlDW溶解待检。

2、PCR扩增

(1)引物设计。以HSV DNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物,一个上游共同性引物,DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′):二个下游特异性引物,DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′ )和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′),可以分别扩增出HSV-1469bpDNA片段(1981~2359)、HSV-2 391bp片段(1561~1953):从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP3 5‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。

(2)PCR实验体系。取模板10μl: DNAP5 0.5(0.2μmol/L):DNAP3-10.5μl (0.2μmol/L):DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L):4×dNTP 8μl(4×200μmol/L):10×dNTp 8μl(4×200μmol/L);10×缓冲液10μl:DMSO 4μl;加DW65.5μl;石蜡油 30μl.。

水煮(96℃~100℃)7min
加TaqDNA聚合酶1μl;(2.5U)
72℃4 min

95℃40s
↓ 65℃60s →72℃70s
↓33个循环
70℃4 min

3.扩增产物的检测和分析

(1)琼脂糖凝胶电泳染色法:取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后,点样于2%琼脂糖凝胶板,70V电泳15~20min,溴化乙锭(EB)染色5min,于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果,HSV-2带在前,HSV-1带在后,无带则为阴性结果。

(2)XhoI酶谱法:取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U,37℃1h后,置3%琼脂糖凝胶中,70V电泳15~20min,可产生46bp片段带(引物后面);与正常PCR产物比较,XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。

(3)Southern印迹法:PCR产物20μl经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90min,转移至硝酸纤维素膜上:80℃烤膜2 h,42℃预杂交(杂交液中)30min,加入32p标记HSVP3探针后,42℃杂交过夜;次日用1%SDS/ PBs pH7.2, 42℃洗15min, 0.5%SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15min; 膜置X线暗盒内放射性自显影12~15h,显影为阳性, 不显影为阴性。

(二)套式PCR

套式PCR(nested primers-polymerase chain reaction,NP-PCR)是通过“外侧”、“内侧”两对引物,即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物,这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度,保证产物的特异性。但该方法不能分型,能100%检出HSV-1,50%检出HSV-2,应改进分型检测HSV,更好地在临床应用和基础研究中推广应用。

1、 标本处理:

(1)标本采集同上

(2)DNA 制备:①脑脊液:取100μlCSF 水煮15min,加入250μl无水乙醇,放-30℃10min;离心10000g30 min,去上清,30℃干燥后,加入10μl DW; ②脑组织细胞:取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,56℃作用1h,水煮10min;取上清加入等体积酚一氯仿(V/V),轻摇10 min,离心10000r/min×10min;取水相,加入250μl DW溶解。

2、PCR扩增

(1)引物设计:选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。

NP-PCR 的引物和探针序列

“外”引物
BJHSV1.1 ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA 19-43
BJHGV1.2 CATACCGGAACGCACCACACAA 218-239
“内引物”
BJHSV1.3 CCATACCGACCACACCGACGA 51-79
BJHSV1.4 CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA 166-188
探针
BJHSV-1PRO TACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT 96-125

(2) PCR实验体系和程序: 反应体积为50μl;模板10μl;BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L); BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L); 10×缓冲液5μl; 4×dNTp 4μl(4×200mmol/L);DW 27μl; 石蜡油30μl。循环参数为95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循环20次, 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增,先95℃变性2min,循环参数为95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循环30次后,72℃延伸5min;。

(3) 扩增产物分析:

① 琼脂糖凝胶电泳染色法:

取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中, 70V电泳15-20min,溴化乙锭染色5min,于紫外灯下观察结果,在溴酚兰后面有一条,或二条亮红条带为阳性结果,HSV-2带在前,HSV-1带在后,无带则为阴性结果。

② Southern印迹法:

PCR产物20μl 经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90min,转移至硝酸纤维素膜上,80℃烤膜2h,42℃预杂交(杂交液中)30min,加入32P标记HSV探针后,42℃杂交过夜,次日用1%SDS/PBs pH7。2,42℃洗15min,0.5%SDS/PBS pH7.2,42℃洗15min;膜置X线暗盒内,放射性自显影12-15h,,显影为阳性,不显影为阴性。

(三)、聚合酶链反应—酶谱法(polymerase chain reaction-endonucleasecleavage PCR-EC)

具有经济广泛等特点;不仅能一次性分型检测HSV-1,HSV-2,EBV,CMV四种病毒,而且方法本身快速、方便、无放射线损伤,易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1,灵敏度高,能检测出中枢神经系统感染第1dCSF中HSv DNA阳性结果,并可用于药物治疗效果的评价。由于病毒的变异性,会出现酶切点突变丢失现象,从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。

1. 标本处理

(1)  标本采集,方法同上。

(2)  DNA模板制备:每份标本取200μl,按200μg/ml加入蛋白酶k,56℃作用1h;

加入等体积的酚—氯仿(v/v)轻摇10min,离心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇,-20℃过夜沉淀DNA,离心15000r/min×5min,吸去液体,30℃干燥后,加蒸馏水25μl溶解,待检。

2. 引物设计:

P1,5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

P2,5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

(1)PCR实验体系:

反应体积100μl; 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ,P20.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×缓冲液10μl, DMSD 5μl, Dw 65μl, 循环参数为94℃60s;60℃60s; 72℃60s;循环40次℃延伸4min。

(2)扩增产物检测与酶切分型.

①第一步电泳鉴定: 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液,加入2%琼脂糖凝胶板,70V电泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外灯下观察,可初步鉴定扩增产物大小。

②酶切分析:分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中,加入50μl无水乙醇,-20℃沉淀DNA,再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解,加入SmaI或BamHi50U于相应Eppendorf 管内,37℃作用1h。

③第二步电泳分型,取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液,加到2%琼脂糖凝胶中,70V电泳,15-20min后,EB染色5min,与同步加入未酶切的PCR产物相对照。 紫外灯下观察,结果如下:

PCR-EC法检测四种病毒结果

病毒型 靶片段 SmaI BamHI
HSV1 518bp 476bp+42bp
HSV2 518bp 225+293bp
EBV 524bp 100bp+424bp 277bp+247bp
CMV 589bp 不需酶切,第一步电泳就可以区分

(四)用RT-PCR检测单纯疱疹病毒

RNA的聚合酶链反应(RNA-PCR),可能通过检测HSV不同期的RNA,这不仅可诊断HSV感染,而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。

RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应(RT)产生cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此,RNA-PCR也可称为RT-PCR。

1、标本处理:

组织块细胞总RNA提取,取100mg组织标本,加1ml硫氰酸胍变性液,于匀浆器中,室温研磨均匀后,移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀,用力振摇10s, 置冰浴15min。10000g4℃,离心20min,取上清水相(上层DNA、下层DNA和变性蛋白质)加入等体积异丙醇置-20℃1h,沉淀RNA。离心 15000r/min×10min,弃上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解,再加0.3ml异丙醇沉淀,-20℃1h, 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min,去上清, 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次, 真空干燥。.加10μl TE缓冲液(pH7.4)溶解,低温保存备用.临用前冰浴溶解。

2、PCR扩增:

(1) 引物设计: 选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因.设计2个引物,

P1  5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′

P2  5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列。

1个探针:5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

(2)PCR实验体系:总反应体积为50μl,模板10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L);P2 1μl (20pmol/L);4×dNTP 4μl(200μmol/L); 10×缓冲液5μl; AMV(逆转录酶)2μl(50U); DW 26μl; 循环参数, 94℃变性2min后 94℃50s,60℃60,72℃60s,循环40次后72℃延伸5min。

3、扩增产物的鉴定:

(1)琼脂糖凝胶电泳染色法:取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液,混匀后加样2%琼脂糖凝胶板,70V电泳15-20min,EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。

(2)Southern印迹杂交法:用32P标记的特异性探针检测PCR产物,方法同上。

总之,在HSV感染性疾病临床诊断中,PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测,远较DNA探针敏感,并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此,PCR无论是作为基础研究手段,还是作为临床检验诊断方法,均具有广阔的前景。

五、病理组织学诊断

细胞内水肿基底层形成大水疱,病灶周围有多核巨细胞浸润,特别是多核白细胞与淋巴细胞充斥于病灶中间。

第九节 鉴别诊断

主要与硬下疳软下疳鉴别:硬下疳为单个质硬的溃疡,无疼痛感,无复发史,实验检查USR(+)或RPR(+),梅毒螺旋体可见。软下疳为质软的溃疡,局部虽有疼痛感但无复发史,实验检查链杆菌阳性。

其他生殖器部位皮肤病如接触性带状疱疹白塞病脓疱病有时与生殖器疱疹相似,可以从病史及检查方面相区别。

第十节 治疗

本病有自限性,约1-2周即可自愈。治疗的目的是防止下次复发。本病目前尚无特效药物,治疗原则为缩短病程,防止继发感染,减少复发。

1.局部疗法:原则为干燥、收敛、保护患部,防止继发感染。可外涂2%龙胆紫溶液,或选用10%次没食子酸铋(代马妥dermatol)、氧化锌油膏或泥膏、紫草生地榆油膏、0.5%新霉素软膏、或0.25%~0.1%疱疹净(IDU)软膏、5%疱疹净二甲基亚砜溶液(用于皮肤疱疹)等。对颜面部者亦可用10%醋酸铝或锌铜合剂。

2.全身治疗:治疗原则其一使感染的HSV不能活化,甚至消灭病毒;其二调节免疫,防止再发,可用阿昔洛韦静滴或口服,丽珠威口服,干扰素肌注,白细胞介素Ⅱ肌注。我们在治疗复发性生殖器疱疹时,使用四医大生物技术中心产的干扰素300万单位肌注,每日一次,10次为一疗程,共三个疗程,适当配合使用白细胞介素Ⅱ或利百或灵杆菌素,95%的病人不复发。

下面介绍别人治疗疱疹方法供参考:

一、 抗HSV药物

(一)无环乌苷是公认的有效药物:

1.原发和初发感染:ACV200mg,每日5次,连服7天;或ACv 5mg/kg,按体重静注,8小时一次,连续5-7天。

2.复发感染时,ACV 200mg,每日5次,连服5天,或ACV800mg,每日2次,连服5天;若在刚开始出现前驱症状时或在损害出现后的2天内即开始治疗,则对部分患者可能有效

3.复发频繁时:ACV200mg,每日3次,可连续服用6-12个月。在经常复发的患者中(每年>6次),每日治疗至少可以减少75%的复发次数,在接受长达3年治疗的人群,已确定是安全有效的。从接受治疗的人群中已分离到耐ACV的HSV株,但免疫功能正常者未见治疗失败者。治疗1年后应停药,以便重新评价患者的复发率。

4.免疫受抑制患者:首发或复发的急性患者:静注ACV(5mg/kg/8h)或口服ACV400mg×4次/日,共7-10天;抑制复发:每天静注ACV(5mg/kg/8h)或口服ACV(400mg×3-5次/天),可预防复发。

5.HSV直肠炎,ACV 400mg,每日5次,可缩短病程。免疫受抑制或重症者可静注ACV5mg/kg/8h。

6.新生儿HSV:现有资料认为,不应该常规应用ACV治疗通过产道感染的无症状婴儿,治疗仅限于有HSV临床表现及产后病毒培养阳性的患儿。所有新生儿HSV感染者应接受ACV或阿糖腺苷治疗。常采用ACV300mg/kg/d,阿糖腺苷30mg/kg/d,静脉注射共10-14天。

7.合并HIV感染:患者需口服ACV间歇或每日抑制治疗。对合并HIV感染者增加ACV剂量是十分有益的。

ACV400mg,口服,每日-5次,治疗有效,应持续用药直至临床症状消失;对重症者,应用ACV静脉给药,对可疑或已证实的ACV耐药株引起的重症患者,最佳方案可能是:ACV400mg/kg,静脉注射,每8小时一次,直至临床痊愈。

HIV感染者中的皮肤损伤粘膜HSV感染时大剂量ACV治疗无反应者日益增多。大剂量ACV对部分患者有助于损伤的愈合,但不能阻止另外一些患者的病情进展。对复发频繁者长期服用ACV不能制止继续排毒,因此,仍可对性伴感染,此时若改用作用机理不同的抗病毒药物如磷甲酸和阿糖腺苷等可能有效。

ACV的抗病毒机理是它很容易被HSV编码的胸苷激酶磷酸化,形成ACV-MP,再被细胞激酶作用而形成ACV-TP。ACV-TP与dGTP竞争而抑制病毒DNA合成。

ACV全身应用治疗首次临床发作或作为抑制治疗药物时,可使疱疹发作的症状和体征得到控制。然而,该药既不能根除潜伏病毒感染,也不能影响以后发作的次数和严重性。该药局部治疗的效果比口服差,故不提倡局部用药。

ACV可缩短生殖器疱疹病程,加速愈合及缓解症状,长期应用可减少复发,曾有人对11000例免疫正常的GH连续治疗5年,在此期间复发率明显降低。

但是长期口服ACV不能清除骶神经节的潜伏病毒,停药后生殖器疱疹仍可复发,对ACV有耐药性病毒株越来越多,几乎所有耐药性都发生于曾经进行多个病程治疗的免疫受损害者。

ACV静脉应用的主要副作用是由于药物在肾实质内结晶而引起的暂时性肾功能不全。若缓慢给药一小时以上或大量饮水则可避免此副作用。

(二)、病毒唑三氮唑核苷,Ribavin RBV):抑制病毒多种DNA及RNA复制,合成。

用量:原发GH及AIDS合并HSV感染,15mg/kg/d,肌注;复发GH,0.4g,口服,每日4次,3天后改为0.4g,每日2次,共5天,疗效肯定,用于耐药病毒株。

(三)、磷甲酸(TrisodiumPhosphonoformate,PFA);选择性抑制疱疹病毒诱导的DNA依赖的DNA聚合酶,主要用于耐ACV病毒株的感染。

用量:40-60mg/kg/d,静脉注射,每8小时1次,连用4次,可用于AIDS合并HSV感染。外用0.3%-1%PFA霜。副使用有肾毒性及钙磷代谢紊乱

(四)、双羟丙氧甲基乌苷(更昔洛韦,Ganciclovir,DNPG):是ACV的衍生物,通过抑制病毒DNA复制,导致RNA合成受阻,感染细胞DNA多聚酶是作用的靶部位。

用量:5-10mg/kg/d,分3次静注,连续14天,副作用有造血系统抑制及肝损害

(五)、氟阿糖碘胞苷(FIAC):对HSV-1和HSV-2有同样作用,选择性作用于被病毒感染的细胞,其代谢产物5-碘尿嘧啶、5-甲尿嘧啶均有抗病毒作用。阿糖腺苷磷酸抑制病毒DNA合成,有广谱抗病毒活性,副使用少,不能防止潜伏感染的建立,但防止病毒进入中枢神经系统有一定保护作用。抗HSV单克隆抗体局部外用,对GH有治疗作用,国外有人报道治疗HSV-2总有效率92.6%,基本治愈率44.1%。

(六)、消炎痛(Indomethacin):作用为抑制前列腺素合成,有助于减少GH的复发,促进conA及PHA(植物血凝素)刺激所发生的细胞增殖作用,加强NK细胞的杀伤能力,可用于复发GH的治疗,用量:25mg口服,每日3次。

(七)、聚肌胞(PolyZIC):是人工合成的干扰素诱导剂,能刺激吞噬作用,增强抗体形成,对免疫系统起调节使用。用量2mg,肌注,2-3次/周。

二、对妊娠GH的处理

对孕妇使用无环鸟苷的安全性尚未肯定,但研究发现,用ACV的孕妇畸胎发生率与正常人相比,并无增高,但ACV对妊娠及胎儿的危险性尚未得出可靠结论。

对威胁母亲生命的HSV感染,如脑炎肺炎肝炎,应采用ACV静脉用药,但无威胁生命的HSV感染,不必全身用ACV治疗。

依照美国传染病学会建议,对妊娠期反复发作的GH处理方案如下:

(一)分娩时如无活动性生殖器损害,则无需剖腹产;

(二) 妊娠未3个月,症状性复发是短暂的,只要分娩时无活动性损害,可经阴道分娩。

(三)临产时有活动GH者,可作如下处理:①羊膜未破,孕妇不发热,胎儿尚未成熟,应延缓分娩;②如系足月妊娠,羊水已破,胎儿肺已成熟,应行剖腹产。

第十一节 预防与护理

(一)避免不洁性交及不正当的性关系,活动性生殖器疮疹患者绝对禁止与任何人发生性关系;

(二)治疗期间禁行房事,必要时配偶亦要进行检查;

(三)对局部损害的护理,应注意保持清洁和干燥,防止继发感染。

(四)治愈后或有复发者,要注意预防感冒,受凉,劳累等诱发因素,以减少复发。

目前尚无特异性预防方法,动物实验表明,接种HSV死疫苗减毒活疫苗,均有免疫效果,因此病毒与某些癌症的关系密切,故不作常规预防使用。最近用纯化的疱疹病毒包膜糖蛋白疫苗,可避免疱疹病毒DNA的致癌危险性。

ACV也有预防作用。阴茎套可能减少疾病的传播,尤其是在无症状排毒期,但出现生殖器损害时,使用阴茎套也不能避免传播。

参看

32 尖锐湿疣 | 巨细胞病毒感染症 32
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