基因诊断与性病/衣原体感染症

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基因诊断与性传播疾病

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沙眼衣原体是(chlamydia trachomatis,CT)是一种在人体内长期生存并又广泛传播的病原体,属条件致病菌。它在一定条件下能引起子宫颈感染早产流产尿道感染等多种疾病,尤其是在与淋球菌等其他病原体合并感染时更加重疾病的发展及引起其它并发症,在无症状子宫颈和男、女性泌尿系统常有沙眼衣原体的存在,其检出率不一。至今,西方国家已有10-20%的人口感染有沙眼衣原体,特别是性接触而传播其感染率更高,成为目前医学所关注的重大问题之一。最近,在对我国大陆性乱人群进行检查时发现,有相当多的人其泌尿生殖系统感染有CT,并已构成我国性传播疾病(STDs)。

一、病原学

衣原体是一类能通过细胞滤器,有独特发育周期、严格细胞内寄生原核细胞微生物。具有以下特点(1)具有DNARNA两种类型的核酸;(2)二分裂方式繁殖,发育周期特别;(3)细胞壁成份中含有肽聚糖;(4)含有核蛋白体;(5)对多种抗生素都敏感。衣原体广泛寄生于人类,哺乳动物及鸟类,仅少数有致病性。只有沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体可以引起人类疾病。

目前已知衣原体有15种血清型。A、B、Ba、C血清型主要引起眼疾患,D-K型引起生殖器疾患,L­1-L3型为引起性病淋巴性肉芽肿的病原体。它们严格称细胞内寄生微生物,大小约300-400μm,在细胞内生长繁殖,有特殊的发育周期,感染力为基本小体,增殖力为网状体,在电镜下可见胞膜有丝分裂繁殖。

衣原体对热敏感,56℃-60℃仅能存活5-10分钟,在-70℃可保存数年。0.1%甲醛液、0.5%石碳酸可将衣原体在短期内杀死,75%乙醇杀灭力很强,半分钟即有效,对利福平四环素红霉素均敏感。

二、流行病学

近年来各种报道显示,淋菌性尿道炎发病率下降,而非淋菌性尿道炎却不断上升,居STDs的首位。其中CT感染所致的病例显著增加,如美国报道非淋菌性尿道炎约半数为CT所致,在淋病中有20-40%从病灶中分离出CT,另据报道男性非淋菌性尿道炎在世界急剧上升,以美国为例、一年间就300万人患本症。女性宫颈炎等,在女性生殖器感染症中CT也是其主要的病原菌

男性非淋菌性尿道炎最常见的病原菌是沙眼衣原体。在美国异性恋男性中沙眼衣原体阳性率达40%,每年约有60万男性患者呈持续性或复发性NGU,同时发现沙眼衣原体宫颈炎妇女其男性性伴侣的感染率为42%,患衣原体尿道炎的男性其女性性伴侣的感染率为62%,无症状的沙眼衣原体感染在性活跃的男人间传播率更高。

引起男性不孕症的因素很多,但最近发现从无生殖力的脓性精液及男子性腺活检标本中分离出沙眼衣原体,进一步提示和证明了沙眼衣原体引起男性不孕症的可能性。有人对淋病感染症的男性患者进行观察,发现体内有高效价的抗衣原体抗体,衣原体阴性淋菌尿道炎者亦有高价抗衣原体抗体,并发现65-85%的非淋菌性后尿道炎是由沙眼衣原体引起。

附睾炎是男性NGU最主要的并发症,在年轻的性活跃的男性附睾炎患者中,45-60%是由沙眼衣原体引起。大多数病人有尿道症状体征,尿道标本和附睾吸取液中可分离到衣原体。

沙眼衣原体性子宫颈炎在女性衣原体感染中最多。因为感染只发生于子宫颈的柱状上皮,而不感染阴道鳞状上皮,故不造成阴道炎。英国去性病门诊就医的妇女衣原体培养阳性率为20-30%,微量免疫荧光法检测血清抗体达60%。淋病患者的宫颈炎标本衣原体阳性率为30-35%,伴不典型宫颈炎或无症状衣原体宫颈感染为3-5%,说明衣原体隐性感染率和混和型感染率相当高,对宫内避孕器的应用者进行测定,发现由避孕器引起的盆腔炎症中大部分是由衣原体感染所致。在男性NGU患者配偶的宫颈中有30-60%分离出衣原体。在与感染的男性性交后约33-49%的宫颈衣原体感染的阳性患者并不表现任何症状,但持续存在于宫颈基层上皮细胞内的衣原体抗原可干扰宿主细胞DNA使之发生恶变。

研究表明,在腹腔镜直视下采取受侵输卵管液检查中发现衣原体阳性率在30%左右、并发现,有40%左右的输卵管炎是由沙眼衣原体引起的,且衣原体感染的孕妇容易发生流产,而流产后多数又引起输卵管炎。许多临床衣原体感染的妇女数年后出现不孕宫外孕、并发现输卵管梗阻所致宫外孕,宫外孕和生育力低下者中沙眼衣原体抗体阳性占81%。

沙眼衣原体的感染可引起男、女性急性尿路综合症,在发达国家,沙眼衣原体引起的女性尿道炎的趋势正在不断地增加,并且正在年轻化,应引起全社会的关注。 我国沙眼衣原体感染属于近年的事,由于临床上较多的泌尿生殖系感染查不出病因,故引起专家们对衣原体感染的临床研究。从1989年我国从14例性乱妇女宫颈标本中分离培养出沙眼衣原体以来,越来越多的研究表明在性活跃期的性乱及正常家庭中,沙眼衣原体的泌尿生殖道感染率在5-25%之间,特别是家庭成员之间的传播更应引起重视,不少儿童性NGU是由沙眼衣原体的感染引起的。

三、传播途径

男性非淋菌性尿道炎约30-70%可通过性交传染给女性,反之亦有25-50%患有衣原体性宫颈炎的女性经性交亦可传给男性。新生儿由母体垂直感染,发生衣原体性结膜炎,有10-20%发生肺炎,女性感染CT还有由宫颈炎上升而并发腹腔内诸器宫感染。由于“口交”亦能引起口腔内衣原体感染。另外,由宫颈、输卵管处分离出CT的事实,也可说明其传播途径。

应该说明一点:当今有些所谓NGU与性行为并无关系,如医源性感染(尿道插管、膀胱镜以及外伤化学性刺激等)。还有所谓NGU并非是由衣原体性微生物所致,在含义上应该与NGU加以区别,因为病原体不同,而传播途径也有所不同,故医生在诊治中要心中有数。

四、发病机理与免疫

衣原体感染人体后,首先侵入柱状上皮细胞并在细胞内生长繁殖,然后进入单核巨噬细胞系统的细胞内增殖。由于衣原体在细胞内繁殖,导致感染细胞死亡,同时尚能逃避宿主免疫防御功能,得到间歇性保护。衣原体的致病机理是抑制被感染细胞代谢,溶解破坏细胞并导致溶解酶释放,代谢产物的细胞毒作用,引起变态反应自身免疫

当人体感染衣原体后,产生特异性的免疫,但是这种免疫力较弱,持续时间短暂,因此,衣原体感染容易造成持续,反复感染,以及隐性感染细胞免疫方面,大部分活动性已治愈的衣原体患者,给予相应的抗原皮内注射时,常引起迟发型变态反应。这种变态反应可用淋巴细胞进行被动转移。此种免疫性很可能是T细胞所介导。体液免疫方面,在衣原体感染后,在血清和局部分泌物中出现中和抗体。中和抗体可以阻止衣原体对宿主细胞的吸附,也能通过调理作用增强吞噬细胞的摄入。

五、临床表现

(一)男性衣原体性尿道炎(chlamydia urethritis,CU)

又称为非淋菌性尿道炎(NGU)。是由衣原体感染引起的非急性化脓性尿道粘膜炎性病变。目前已成为STDs中最常见的一种。

本病潜伏期比淋病长,约1-3周或数月,主要表现为尿道内不适,刺痛及烧灼感,并伴有不同程度的尿频尿急尿痛,尿痛较淋病为轻。尿道口轻度红肿并有浆液或粘液脓性分泌物,稀薄而量少,长时期不排尿或早晨首次排尿前可见尿道口分泌物污染内裤,并可见尿道口有“糊口”现象;分泌物少时,于晨起挤压尿道才流出少量粘液。合并膀胱炎时可有血尿;无症状性非淋菌性尿道炎,约30-40%病人症状不典型或根本无症状。约1/3左右的淋球菌尿道炎病人合并沙眼衣原体感染,淋病治愈后又出现尿道炎症状,易误诊为慢性淋病或PPNG菌株感染。

沙眼衣原体感染易并发附睾炎,表现为附睾肿大,变硬及触痛,多为单侧,部分患者的抗沙眼衣原体抗体升高,可直接从附睾抽吸液中分离出沙眼衣原体;累及睾丸可出现睾丸炎,表现为睾丸疼痛、触痛、阴囊水肿输精管变硬变粗;累及前列腺时可出现后尿道、会阴肛门部位钝痛或触痛,可有性功能障碍,直肠镜检可触及有压痛的前列腺。如前列腺明显肿大,可压迫后尿道而出现尿流变细、排尿无力尿流中断等;本病还可以合并Reiter综合征,即关节炎,结膜炎,尿道炎三联症。

(二)女性生殖系统衣原体感染症

女性感染衣原体不限于尿道,可累及整个泌尿生殖器官,此类感染常因缺乏自觉症状或症状轻微而忽视了治疗,造成传染源而扩散,形成危害。

女性衣原体感染比男性感染引起的症侯要多,其主要感染部位为宫颈,由此垂直感染给新生儿,以至发生PID等,其后遗症多导致不孕症。

无症状感染(缺乏症状反应):由于本病缺乏自觉症状,则局部病象便成为诊断的一个重要指标,表现为阴道有脓样分泌物,亦可为粘液或浆液性。分泌物量较多(为中等量),稍有臭味。阴道粘膜为正常颜色,但常伴有宫颈糜烂

衣原体性宫颈炎:当伴发宫颈炎时、宫颈发红,有浆液或脓性分泌物增加、阴道内糜烂扩大,易于出血等症状。镜检下阴道分泌物的所谓“阴道清洁度”多为III度以上。沙眼衣原体主要侵犯宫颈的柱状上皮细胞,而磷状上皮细胞常不被侵犯,故阴道,宫颈局部没有改变。

宫颈炎的主要症状是白带增多,不时出血及小腹部疼痛等一般症状,无特异性表现,多因其性伴患有尿道炎而来院就诊。

衣原体性输卵管炎,本症多由宫颈炎并发引起。用腹腔镜直接从输卵管抽吸物标本中,约30%以上检测出衣原体,病情经过多数较轻、下腹部可有轻微疼痛,一般体温不高,但血沉稍快。由于这种非典型经过,使病人拖延就医,往往引起子宫附件损害,形成输卵管炎的后遗症,其最主要表现是输卵管性不孕症。

盆腔炎(PID):PID不是固定疾患的用语,凡在盆腔内感染症,如宫内感染,输卵管炎等附件炎症波及盆腔腹膜特定的部位感染均可称之为PID,由CT引起的PID主要是由宫颈炎上行感染所致。其主要表现是急腹症型。

部分患者可导致宫外孕、流产、不孕、死胎及新生儿死亡。有些病人除不孕外,可无任何症状。也可通过产道传染,引起婴儿眼结膜炎、鼻炎中耳炎、肺炎及阴道炎等。

六、诊断与鉴别诊断

诊断衣原体性疾患,目前在我国尚未普及,因此,往往漏诊,所以应当重视临床表现,争取做到化验室检测指标求得确诊。

患者来就医时,男性主诉常常是尿道疼,不适感或从外尿道流出脓样粘液,或因患“淋病”久治不愈,反复出现上述现象;女性病人常常无症状,只是白带多或因其丈夫有“淋病”史,特意来检查确诊。

(一)临床症状

首先应排除淋菌性尿道炎

衣原体性尿道炎与淋菌性尿道炎鉴别

临床病症 沙眼衣原体 淋球菌
潜伏期 1-3周 2-5日
发病 缓慢 突然
尿路刺激征 轻或无 多见
全身症状 偶见
尿道分泌物 少或无,粘液性或浆液性稀薄 常见,量多呈脓性
无症状带菌者 相当多 有,但不多
白细胞内G-双球菌 (一) (+)
病原菌培养 沙眼衣原体 淋球菌

(二)实验室诊断

检测出病原体或病原体特异性DNA是诊断本病唯一标准,近年来由于对CT直接分离培养成功,加之基因诊断技术在CT诊断方面的成功应用,使过去认为难以诊断的疾患已提高到最易诊断的一种疾患,但是上述两项技术特殊,对操作人员及实验设备要求严格,在一般医院实行起来尚难完成。一般只用CT抗原法进行诊断。

1.衣原体细胞培养:对沙眼衣原体敏感的细胞株为McCoy细胞、Hela-229细胞和BHK细胞,最常用的是经放线菌酮处理的单层McCoy细胞,孵育后,用单克隆荧光抗体染色,可迅速诊断,但操作人员一定要熟练,需专业培养。培养法的敏感性为80%-90%,阳性即可确立诊断。

2.衣原体细胞学检查法:在感染细胞内可有衣原体的包涵体存在。从感染部位采取细胞标本作涂片,姬姆萨染色包涵体是蓝色或暗紫色,碘染色显示褐色。但敏感性差(40%),目前已较少采用。

近年来采用荧光素标记的抗衣原体单克隆抗体,来检测细胞涂片中的衣原体,使用较为方便,目前主要用衣原体外膜蛋白(MOMP)的单克隆抗体的商品试剂(Mico Trak,Pathfinder,Monofluor)。结果判断:要衣原体数>10个才能判为阳性。

3.PCR检测衣原体DNA:

(1)标本的处理:

①取材部位为子宫颈管,男性为尿道,将灭菌白金耳深入宫颈管或尿道1cm左右,转动数圈,停留约30s,取出后置标本缓冲液中。

② 衣原体DNA提取:

将宫颈管内或尿道内刮取物置含0.5% NP-40、0.5%Tween 20,1% SDS和2mg/ml 蛋白酶K的TES缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,50mmol/l NaCl,100mmol/L EDTA,pH 8.0)置37℃裂解60min,沸水5min,酚、氯仿抽提DNA,乙醇沉淀,沉淀物溶于20μlTE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 8.0)。

(2)引物设计:

引物对选自衣原体16SrRNA基因,为衣原体属特异性,以DNA合成仪固相亚磷酸三酯合成并纯化。引物对的序列分别为5′GTGGATAGTCTCAACCCTAt 3′(16SrRNA基因位点832-851)和5′TATCTGTCCTTGCGGAAAAC3′(位点1041-1022)。目的扩增片段(832-1041)长210bp。

(3)PCR扩增:

传统的方法反应体积为100μl,含5x反应缓冲液20μl和FD-DNA聚合酶2U、4种dNTP各200μmol/L以及引物对各25pmol/L。上述成分预先一次性分装于0.5ml离心管,-20℃备用。临用加模板DNa 2μl,短暂离心,加100μl矿物油覆盖。现在试剂已商品化,反应体积为25μl,单管已分装好,只要加入模板DNA即可。置DNA扩增仪进行40次循环扩增。每次循环包括90℃变性45s(第一次循环变性2min),55℃退火30s和72℃延伸40s(最后一次循环72℃,延伸5min)三个步骤。每次扩增均应作阴阳性对照。

(4)扩增产物的检测

① 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测:取10u l PCR扩增物作1.5%琼脂糖凝胶电泳、0.5μg/ml溴化乙锭染色,以PGEM-3Zf(+)DNA-Hae Ⅲ为分子量标准,置紫外透射仪观察结果。

生物素寡核苷酸探针的检测

a.探针序列及合成:探针序列为5′ACTCAA-AAGAATTGACGGGGGCCCGCACAa3′(30mer),衣原体16Sr RNA基因中的位点为909-938,与PCR扩增片段中间序列互补。以DNA合成仪固相亚磷酸三酯法合成并纯化。

b.标记:按Riely等方法略有修改。以末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)催化Bio-11-dUTP标记到合成的寡核苷酸探针片段3′-OH端。反应体系含:140mmol/L二甲胂酸钠,30mmol/l Tris-HCl(pH 7.6),100μmol/L Bio-11-dUTP,0.1μmol/L 寡核苷酸片段,0.05%BSA,300U/mlTdT。于37℃保温3h后,加10mmol/LEDTA终止。寡核苷酸片段探针标记后,将标记探针(1ng/μl)作2倍系列稀释,取5μl点膜,封闭后显色。结果探针经32倍稀释(最高稀释度5ng)后仍呈现明显的显色反应,证实探针的标记以及显色效应良好。

c.DNA斑点杂交:提取的DNA或其PCR扩增产物0.5mol/l NaOH变性20min,取5μl点于硝酸纤维素膜,烘干;以6×SSC(1xSSC为:0.15mol/l NaCl,0.015mol/L柠檬酸三钠,pH 7.0)浸泡2次,80℃干烤2h。置6×SSC,5×Denhardt液,0.2%SDS,50μg/ml变性牛胸腺DNA,10mmol/l EDTA中于55℃杂交3h后,加入终浓度为150μg/ml的探针,于55℃杂交过夜。以2×SSC-0.1%SDS室温漂洗3次,每次min。

d.显色:将杂交漂洗后的滤膜浸泡于0.1mol/l Tris-HCl (pH7.5),0.15mo l/L NaCl,0.05%Tween20,0.05%%TritonX-100,2%BSA中,37℃封闭6min;置4μg/ml亲和素的缓冲液A(0.1mol/l Tris-HCl,0.15mol/LNaCl,pH 7.5)中,37℃孵育30min,缓冲液A漂洗3次;再置于含1μg/ml生物素化碱性磷酸酶的缓冲液A中,37℃作用30min,缓冲液A漂洗2次,缓冲液B(0.1mol/lTris-HCl,0.1 mol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH 9.5)漂洗2次。最后将膜泡于含0.1mg/ml磷酸萘酚AS-MX和0.6mg/ml坚固蓝RR的缓冲液B中,暗处显色30min。

PCR扩增衣原体DNA有十分高的特异性及敏感性,结合生物素标记的衣原体寡核苷酸探针作DNA斑点杂交。可作为衣原体诊断的金标准,其敏感度可以检测相当于1个拷贝的衣原体DNA分子

七、治疗

衣原体对作用于细胞壁的药物耐药,如青霉素类万古霉素杆菌肽,对于抑制膜蛋白和胞浆蛋白合成药物敏感,如四环素、红霉素等。

治疗方案

首先四环素类,四环素500mg每日4次,连服7天,或用强力霉素100mg每日2次,连服7日。对四环素禁用或耐受性差的患者,可改服红霉素500mg,每日4次,连服7日,复方新诺明亦有效。

另外近年来新开发的对各领域的感染症广泛使用的新药喹诺酮类,在治疗衣原体方面临床效果较好,其中常用的药物有氧氟沙星(OFIX),环丙沙星(CPFX),洛美沙星,利福平治疗效果也较好。

治疗中应注意的问题:

(1)四环素类药物妊娠妇女有致畸作用,故应禁用。

(2)从目前临床观察来看用喹诺酮类药物比应用四环素类药物为好,因为患者多数有淋球菌或其它合并感染。

(3)治疗时间2-3周为宜。衣原体繁殖周期为48-72小时,寄生在细胞内,药物渗入细胞内的浓度一般较低。所以治疗时间需要长些。

(4)在男女感染后无症状或症状轻微者,可视为带菌者,应接受正规治疗。对患者的性伴要同时治疗。

(5)联合用药:四环素类+喹诺酮类

红霉素类+喹诺酮类

四环素类+利福平

喹诺酮类+利福平

参看

32 非淋菌性泌尿生殖道炎 | 支原体性感染症 32
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