石蜡切片

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       石蜡切片(paraffin section) 组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构,也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法,而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中,光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别出;组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此,组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡,而能清晰辨认其形态结构。  

石蜡切片制作基本技术

石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日,但标本可以长期保存使用,为永久性显微玻片标本。

1.取材 应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖,细胞分裂快又便于切取;猪的肝小叶边界清晰明确;耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜,搁置时间过久则产生蛋白质分解变性,导致细胞自溶细菌的滋生,而不能反映组织活体时的形态结构。

2.固定 用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料,迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化,尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化,有利于切片的进行,而且也有媒浸作用,有利于组织着色。固定液的种类很多,其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪,甲醛能固定一般组织,但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛(蚁醛、福尔马林)、酒精、醋酸冰醋酸升汞锇酸四氧化锇)、重铬酸钾苦味酸等,单一固定液不能固定细胞中的所有成分;混合固定液可以互补不足,常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液(配方见有关技术书籍)。因此,应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10%福尔马林(4%甲醛)或10%磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液,不仅适用于常规HE(苏木精-伊红)染色,还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右,固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定,可以从1小时至数天,通常为数小时至24小时。

3.洗涤与脱水 固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀,否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗;使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗;如果组织经酒精或酒精混合液固定,则不必洗涤,可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分,如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋,因为透明剂多数是苯类,苯类和石蜡均不能与水相融合,水分不脱尽,苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂,它既能与水相混合,又能与透明剂相混,为了减少组织材料的急剧收缩,应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行,通常从30%或50%酒精开始,经70%、85%、95%直至纯酒精(无水乙醇),每次时间为1~数小时,如不能及时进行各级脱水,材料可以放在70%酒精中保存,因高浓度酒精易使组织收缩硬化,不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。

4.透明 纯酒精不能与石蜡相溶,还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液,替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍,出现透明状态,此液即称透明剂,透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等,各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1~2小时,再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短,则透明不彻底,石蜡难于浸入组织;透明时间过长,则组织硬化变脆,就不易切出完整切片,最长为数小时。

5.浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂,使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1~2小时,再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右,浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行,以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中(摆好在蜡中的位置),待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却,即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多,应进行编号,以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用,以免因含杂质而影响切片质量,且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56~58℃或60~62℃两种,可根据季节及操作环境温度来选用。

6.切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台,以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上,夹在轮转式切片机的蜡块钳内,使蜡块切面与切片刀刃平行,旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量,可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4~7微米,切出一片接一片的蜡带,用毛笔轻托轻放在纸上。

7.贴片与烤片粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上,以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油,再将一定长度蜡带(连续切片)或用刀片断开成单个蜡片于温水(45℃左右)中展平后,捞至玻片上铺正,或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上,再把蜡片放于水滴上,略加温使蜡片铺展,最后用滤纸吸除多余水分,将载玻片放入45℃温箱中干燥,也可在37℃温箱中干燥,但需适当延长时间。

8.切片脱蜡及水化 干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡,再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中,则将切片移至与酒精近似浓度时,即可染色。

9.染色 染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似,不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多,应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法,还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精(Hematoxylin)和伊红(曙红,Eosin)染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色,简称HE染色。经HE染色后,细胞核被苏木精染成紫蓝色,多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料,染液呈碱性,核内染色质胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性,称嗜碱性;而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性,对这种染料的亲和性,称嗜酸性。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示,称特殊染色。有些细胞组织经硝酸银浸润后,可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上,呈棕黑色,这种性质称亲银性,而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银,还需加还原剂才能将银离子还原,称嗜银性。

10.切片脱水、透明和封片 染色后的切片尚不能在显微镜下观察,需经梯度酒精脱水,在95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底;如染液为酒精配制,则应缩短在酒精中的时间,以免脱色。二甲苯透明后,迅速擦去材料周围多余液体,滴加适量(1~2滴)中性树胶,再将洁净盖玻片倾斜放下,以免出现气泡,封片后即制成永久性玻片标本,在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度,掌握适宜的染色时间,才能达到较好的染色效果。

石蜡制片程序及环节繁多,需数日才能完成1个周期,但切片可长期保存,供教学、科研及病理诊断及复察,并可利用蜡块作其他项目的回顾性研究。病理常规制片过程中已简化了一些细的环节或缩短了部分处理时间以适应临床需要(可缩短至2天)。虽然冰冻切片大大快于石蜡切片,但所显示的形态结构却不如前者,因此病理医生最后还需要根据石蜡切片作出准确诊断。近些年来,在病理常规制片过程中采用了微波技术,从而大大缩短了制片过程,而且对形态结构并没有影响。微波是一种波长很短、频率却很高的高频电磁波[波长为1米 ~1毫米,频率为300兆赫(MHz)~300千兆赫(GHz)]。组织经微波辐射后加速组织内部分子的高速运动,以使液体的运输加快,增加弥散、渗透和交换效率,从而加速组织的固定、脱水、透明、包埋和染色各个环节。例如常规福尔马林固定需数小时~1天,而且能引起组织收缩及某些抗原成分不同程度的受到破坏,微波固定仅需1~2分钟,且可减少抗原的丢失和损害。选择适当的档次(功率)、辐射时间和温度是极为重要的。目前微波技术的应用在国内尚处于起步阶段,许多技术应用环节尚需进一步摸索。

石蜡切片与其他技术方法的结合 石蜡切片虽然是经典的方法,但又是最基本的方法,它与其他新的技术方法相结合,使传统的老技术扩大了其应用范围,开辟了许多新领域,增加了许多新的研究、观察内容。随新的仪器及新的研究技术的不断问世及使用,使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察,又从定性转向定量计测,使细胞组织的形态,功能及代谢三结合,从而达到定性可靠、定位准确及定量可测。  

免疫学技术结合

组织制片技术与免疫学技术结合构成免疫组织(细胞)化学技术,利用抗原与抗体的特异性结合原理,检测组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质的定性和定位观察研究。不论哪种免疫组织化学技术都包括抗体的制备、组织材料处理、制备玻片标本以及免疫染色。冰冻切片手续简便,制片过程中抗原活性丢失少,但组织细胞形态较差;石蜡切片步骤繁多,制片中抗原活性有所减低,但组织细胞形态清晰,是免疫组织化学常规制备切片方法之一。一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原,不宜做表面抗原染色,有人将新鲜组织浸泡于冷磷酸缓冲液内48小时,再固定于96%乙醇或其他固定液固定的组织切片,可用于表面抗原染色。乙醇、丙酮等固定剂对抗原破坏较轻,但结构保存较差。最常用的固定液有中性和缓冲福尔马林,它可与蛋白质交叉结合封闭抗原,在进行免疫染色前,切片再用蛋白酶消化,以暴露抗原部位、增强抗原的反应。在石蜡切片上进行的常用的免疫组化染色有免疫酶组织化学技术中的PAP法(非标记过氧化物酶-抗过氧化物酶法)及亲和免疫组织化学技术中的ABC法(抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术),其特异性强、敏感性高。使用两种染色法的组织切片都需先经第一抗体(各种抗血清)孵育;再经第二抗体或生物素标记的第二抗体孵育;后经PAP复和物或ABC复合物孵育,最后以DAB(二氨基联苯胺)-H2O2液显色呈棕黄色沉淀。常规复染、脱水、透明、封片成永久性玻片标本,光镜下检测常规或特殊染色法难以显示的成分及其精确定位,可用于基础研究及临床病理研究及诊断。微波用于石蜡包埋切片免疫组织化学染色既简化步骤又节省时间,且能促进免疫染色效果。

石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析 是石蜡包埋组织切片与流式细胞术(flow cytometry,FCM)结合使用来测量DNA含量及倍体分析,这一结合是流式细胞仪在临床应用中,特别是在肿瘤研究方面开拓了新的研究途径。FCM是激光、电子和电子计算机、流体喷射技术的综合发展应用,是快速定量分析细胞的技术,要求被检细胞呈悬浮状态。目前已可测量细胞的大小、体积、DNA含量、DNA合成速率、RNA含量、表面抗原、染色体等。由于制备样品技术的原因,过去许多流式分析资料仅限于采用新鲜组织标本,Hedley等1983年首先报导了FCM分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测,从组织切片中能获得足够数量的单个细胞,且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似。目前国内也在逐步开展这方面的研究。由于这种方法取材可在病理组织观察或诊断基础上进行,比活检或手术切除标本更为准确,又可做回顾性研究分析;且对DNA检测速度快、数据客观可靠,在肿瘤诊断、预后的预测和治疗反应上具有重要价值;利用过去的标本可成批制作细胞悬液、成批上机测试,避免了仪器调试状态不同带来的影响,石蜡包埋块保存时间的长短对结果影响不大。

常规固定(多数用福尔马林)、石蜡包埋的组织块均可用于流式细胞术,但含苦味酸或汞的固定液均不宜使用。切片厚度以30~50微米为宜。切片脱蜡要干净、彻底,否则制备出的细胞悬液中碎片多,影响测定。梯度酒精水化后用胃蛋白酶胰蛋白酶消化,消化后镜检呈单个分散状态;由于福尔马林固定可使DNA和核蛋白产生共价交联,影响DNA和染料的化学定量结合,导致荧光强度下降,蛋白酶可破坏其联结,改善测定的组方图质量,消化时间以能分散细胞及细胞碎片尽量少为适度,以100目尼龙筛网滤去未消化完的组织片,离心去上清液后,加入冰冷的70%酒精固定,放入4℃冰箱备用。上机前染色。DNA特异荧光染料主要有:(1)碘化丙锭(PI);(2)溴化乙锭(EB);(3) 4,6-二脒基-二苯基吲哚(DAPI)。FCM检测石蜡包埋组织细胞DNA含量可做为以形态学为基础,多参数综合诊断中的一个重要的新手段。由于仪器设备价格昂贵及制备样品的诸多环节均可能影响测定的数据,限制了临床的广泛使用。

石蜡切片标本是形态计量技术的基础 形态计量技术是近年发展起来的一种新的定量检测技术,用全自动图像分析仪对组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、长度及表面积等的图像数据进行数学处理,以便对生物组织细胞及其结构成分的形态进行定量分析,如线粒体个数、内质网、细胞核及胞质面积、胰岛的数量及各类细胞的数值、肾小体的数量和体积比以及Feulgen染色测定细胞核DNA原位定量等,使组织学及细胞学的研究由形态及定性观察转向形态定量化。形态计量是从石蜡组织切片或涂片以及组织的光镜照片和电镜照片上的各种结构获取二维图像数据,通过软件程序处理,得出有价值的结构参数。这种数据准确性高、客观性强、重复性好、可减少或弥补观察者的主观性差异。形态计量已应用于临床病理诊断工作,包括非肿瘤病变与肿瘤病变。国内对非肿瘤性病变的研究已涉及到动脉粥样硬化肝硬变前列腺肥大、克汀病胰腺炎精索静脉曲张等;而对肿瘤病变的研究则是形态计量学在临床研究的重点,目前较集中于消化道、肝、膀胱乳腺和肺等器官的肿瘤。此外,在疾病的发生过程中把形态计量参数与功能变化指标有机地结合,有利于探讨疾病的发病机制;形态计量参数对肿瘤病变的治疗效果及预后判断的估计亦有参考价值。

在形态计量学的研究中,首先是对样品质量要求较高,例如制片过程中组织的收缩、膨胀与挤压、切片厚度与方向,特别是切片染色技术,染色是使组织或细胞各成分能染成不同色泽而便于识别,提高待测成分图像的可测性及其内在组分的表达性,使待测成分的色彩和亮度明显清晰地区别于它的背景。采用常规染色、特殊染色以及免疫组织化学染色,可对不同着色的成分及反应物作形态定量测定;利用免疫组织化学和原位杂交技术使病灶染色,再作形态定量测量。其次是要找出特征结构参数或定量指标,可先检测组织或细胞的各种可测参数或根据待测成分的形态特点设计一些参数,再用统计学方法筛选出有用的参数作定量测定。由于仪器昂贵,目前国内尚处在实验研究阶段,临床上的广泛应用尚有一定困难。形态计量技术与常规技术和其它新技术综合研究方法的使用,具有较好的应用价值及效果。

随着各种新仪器的问世和新技术方法的不断建立与使用,石蜡切片技术也逐渐扩展、渗入许多新领域中,做为基础技术提供有效的实验或使用样品。石蜡包埋组织切片还可用于细胞原位核酸分子杂交技术中,可对材料中被杂交的DNA分子进行定位、含量分析或观察基因表达(mRNA)水平;聚合酶链式反应(PCR)技术可用于固定、石蜡包埋组织的DNA分析,使研究进入了分子水平,但在短期内这些技术尚不能做常规使用。

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