细胞组织

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1.细胞工程在植物方面的应用

⑴微繁殖技术(Micropropagation)的应用

微繁殖技术,即以植物的器官、组织、细胞原生质体外植体,在离体培养条件下进行植株再生的技术。应用微繁殖技术既可用于克服高度杂合物种因有性繁殖而引起的后代严重分离,如澳大利亚的番木瓜;有可用于名优或濒危物种的快速繁殖,如凤梨、草莓。通过微繁技术已获再生植株的树种主要有番木瓜、柑橘、龙眼荔枝苹果、梨、葡萄等,草莓、香蕉等以实现了商品化生产。

通过茎尖培养或微嫁接技术,可以脱去植物体内的病毒,获得无病毒苗木,如苹果、草莓等。另外,在组织培养过程中,如愈伤组织培养、细胞悬浮培养原生质体培养等,通过pH值、温度、离子浓度等条件的变化,可增加其变异,从中可筛选出优良的突变体,从而为新品种的选育开辟一条崭新的途径。

愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等是基因转化的良好受体材料,并且在离体培养条件下进行植株再生也是实现植物遗传转化的重要环节。

此外,微繁技术为种质的保存(germplasm storage)提供了新方法。很多种质资源在离体培养条件下,通过减缓生长和低温处理而达到长期保存目的,并可进行不同国家、地区间的种质资源收集、互换、保存和应用,即建立“基因银行”(gene bank),实现种质资源的全球共享。例如,在比利时Catholic University的Leuven研究中心有大量离体保存的香蕉种质库。

⑵细胞大量培养与有用次生代谢产物生产

细胞大量培养有用次生代谢产物是植物细胞工程另一个重要应用领域。通过细胞工程技术,刺激植物体内某些重要次生代谢产物的合成和积累,然后进行分离、提纯,如某些名贵药物、香精、色素等,实现植物产品的工业化生产。

早在1964年我国就开始进行人参细胞培养。1980年以后,我国研究者相继开展了紫草三七、红豆杉、青蒿红景天和水母雪莲等植物的细胞大量培养和研究,并利用生物反应器进行药用植物的细胞大量培养的小试和中试。其中新疆紫草中试的规模达到100L,并小批量生产了紫草素,用于研制化妆品抗菌、抗病毒和抗肿瘤药物。红豆杉细胞大量培养在我国也获得初步成功,从细胞培养物中得到了珍贵的抗癌药物紫杉醇,但产率还有待提高。

单倍体(Haploid)技术的应用

单倍体育种和相关研究在农业和园艺植物中得到了广泛的应用。用Blakeslee等(1922年)和Kostoff(1941年)分别得到了单倍体植株单倍体有利于突变的检测和抗性细胞系的筛选,并且大大缩短了育种的时间。此外单倍体在基因图谱、基因转移研究中具有重要作用。

自然形成的单倍体是极少见的,并且仅限于几种植物。花药培养是单倍体形成的重要途径。自1964年第一例花药培养获得成功以来,花药培养技术已取得了显著的进展,尤其在水稻、小麦、玉米等作物中已获得巨大成功。现已取得成功的果树树种主要有番荔枝(Nair等,1983年)、番木瓜(Litz和Conover,1978年)、4个柑橘品种(Chen,1985年)、龙眼(Yang和Wei,1984年)、荔枝(Fu和Tang,1983年)、苹果(Zhang等,1990年)、梨(Jordan,1975年)、葡萄(Rajasekaran和Mullins,1979年)等。薛光荣等(1980年)对东方草莓(四倍体)的单核期花粉进行培养,成功的诱导出单倍体植株。

花药培养主要是受基因型、花药的发育阶段、预处理和培养条件的影响,其存在的主要问题是单倍体的诱导频率低,单倍体自发加倍形成的二倍体体细胞组织形成的二倍体很难区分。例如,Fowler等(1971年)、Nishi等(1974年)和Rosati等(1975年)以八倍体草莓花药为材料诱导愈伤组织,并分化出植株,发现其再生植株仍为八倍体,这些八倍体是由无性器官发育而来,还是由单倍体自发加倍而成则难以区分。

除花药培养外,植物的卵细胞助细胞反足细胞等单倍体细胞通过离体培养可以分化成单倍体胚或愈伤组织。胚珠、子房培养也曾进行了大量尝试,但大多数情况下,在愈伤组织阶段生长停止。

⑷胚培养(Embryo culture)

胚的离体培养是直接应用于植物改良最早的组织培养技术。胚培养可以克服杂交后胚的衰亡,保证种内或种间杂交的成功,或用于无性繁殖困难的植物的培养。胚培养还可以克服种子的休眠和败育。Magdalita等(1996年)和Drew等(1997年)分别进行了番木瓜的种内杂交,得到合适的胚子后,进行了胚培养,以促进杂交成功。Jordan(1992年)得到了愈伤组织,但未得到再生植株。

澳大利亚国际农业技术研究中心对番木瓜和其野生种的杂交胚进行了培养研究,已获成功,并得到了杂交后代,野生种的抗性、高含糖量等优良性状得到了遗传。荔枝是较难进行离体培养的果树树种之一,Kantharajah等(1992年)培养了长度为3mm的荔枝幼胚。其他通过未成熟胚培养进行再生的树种有鳄梨、番荔枝和番木瓜等。姚强(1990年)对桃、油桃和番桃花后60d的未成熟胚进行培养,获得了再生植株。J.Button等(1975年)利用甜橙种胚愈伤组织离体培养获得了完整植株。

⑸原生质体培养(Protoplast culture)与体细胞杂交(Somatic hybridization)

原生质体是去掉细胞壁的单细胞,它是在离体培养条件下能够再生完整植株的最小单位。每个原生质体都含有该个体的全部遗传信息,在适宜的培养条件下,具有再生成与其亲本相似的个体的全能性。原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合,克服远缘杂交障碍,实现体细胞杂交,从而产生杂交后代。在原生质体培养过程中,往往产生大量的变异,可从中选择优良突变体。原生质体可以摄取外源细胞器、病毒、DNA等各种大分子遗传物质,是进行遗传转化的理想工具,此外,在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的,可为细胞生物学、发育生物学细胞生理学细胞遗传学及其他一些生物学科建立良好的实验体系。

Lizz(1986年)曾分离得到番木瓜的原生质体,Krikorian等(1988年)分离得到了香蕉的原生质体,但二者均未得到持续分裂的细胞。Nyman等(1987年,1988年)首先报道了草莓栽培品种Sengana和Canaga试管苗叶肉原生质体培养及植株再生。1992年,他们获得了草莓试管苗幼叶和叶柄原生质体的再生植株。Infante等以森林草莓用(Fragaria vesca)Alpine营养系试管苗叶片和叶柄为材料分离原生质体,并获得了再生植株。愈伤组织和悬浮细胞是制备原生质体的重要材料,但在落叶果树上,只有少数树种利用愈伤组织或悬浮细胞分离原生质体并获得培养的成功,其中最成功的树种当属猕猴桃。蔡起贵等(1988年)通过愈伤组织分离出中华猕猴桃的原生质体,并获得了再生植株。Kovalenko等(1990年)和Ochatt等(1988年)分别在Colt樱桃和欧洲葡萄上利用悬浮细胞系分离原生质体并获得再生植株。

林定波等(1997年)以胚性愈伤组织为材料,分离得到锦橙的原生质体,并获得了再生植株。易干军等(1997年)也以胚性愈伤组织为材料,分离得到柑橘(红江)的原生质体,并获得再生植株。但以叶肉为材料分离得到的原生质体未获得成功。马锋旺等(1998年)对山杏的原生质体进行了分离和培养,在适宜条件下,山杏原生质体4~5d变形,5~6d开始第一次分裂,20d左右可形成15~20个细胞的小细胞团,60d后可形成肉眼可见的微愈伤组织。微愈伤组织经继代培养后,可诱导不定芽和不定根,形成完整植株。丁爱萍等(1994年)曾对苹果进行了原生质体培养和植株再生研究,以胚性愈伤组织建立的悬浮细胞系为材料,分离得到原生质体,并获得了再生植株。

植物细胞在去除细胞壁后,能像受精过程那样相互融合,可实现常规杂交不亲和的亲本之间进行遗传物质重组,从而开辟了体细胞杂交的新领域。体细胞杂交已广泛用于植物育种,已在胞质雄性不育、抗病等方面取得了显著进展。同时,在木本果树植物上也得到了有经济价值的体细胞杂种植株。

目前两种最有效的融合系统PEG——高pH/Ca2+ 方法和电击融合方法。

第一例体细胞杂交是通过西红柿和马铃薯原生质体融合实现的。原生质体融合技术在柑橘种间杂交中得到大量应用。Ohgawary将甜橙的原生质体与飞龙的原生质体融合,得到了体细胞杂种植株。

美国学者Grosser将甜橙的悬浮培养细胞的原生质体与豪壳刺属的Severinia disticha 愈伤组织的原生质体融合,得到了属间异源四倍体的体细胞杂种植株。S.distcha 具有抗病、耐寒、耐盐等优良性状,适合作柑橘的砧木

⑹转化(Transformation)

分子生物学的飞速发展,导致了植物科学的一场革命。经过多年的探索,人们从分子水平对生物学和遗传学有了深刻的认识,与组织培养技术相结合,分子生物学技术已开始应用于植物基因组的修饰和改变。

由于基因编码的同一性,任何有机体内(如病毒、菌类、昆虫)的有用基因都可以转入到植物体。由于基因(如抗虫或抗病基因)的导入,导致了新的基因型的出现或实现基因型的改良,可选育出抗虫或抗病的基因型。

目前已经分离或应用的目的基因主要有抗植物病虫害基因、抗非生物胁迫、改良作物产量品质的基因、改变植物其他性状的基因等。

有关外源基因导入植物细胞的方法有多种,如农杆菌质粒介导法(包括Ti质粒的Ri质粒)、植物病毒载体介导法、DNA直接导入法(包括PEG介导、脂质体介导等化学诱导DNA直接转化法,电激法、超声波显微注射激光微束、基因枪法等物理诱导DNA直接转化法等)和种质系统介导基因转化法(包括花粉管导入法,生殖细胞浸泡法,囊胚、子房注射法等)。目前最常用且最为有效的方法为根癌农杆菌介导法和基因枪法。自1983年首次用农杆菌介导法在烟草和马铃薯上取得成功以来,约有120种植物采用此方法进行转化。农杆菌介导法对双子叶植物十分有效,但在单子叶植物中也已开始应用。基因枪法既可以愈伤组织作为受体,又可以悬浮细胞作为受体,并且对单双子叶植物都十分有效。

2.细胞工程在动物方面的应用

⑴快速繁殖优良、濒危品种及新品种

借腹怀胎提高种畜的利用率。20世纪30年代胚胎移植在绵羊和山羊中取得成功;1982年国学者获得世界上第一胎试管牛。通过体外受精、细胞核移植技术、胚胎分割、胚胎融合等技术达到快速繁殖的目的,也有可能创造出高产奶牛、瘦肉型猪等新品种。通过胚胎工程、克隆技术等进行大熊猫、东北虎等珍稀动物的繁殖。

⑵利用动殖物细胞培养生产活性产物、药品

主要各种疫苗抗体等。1975年国剑桥大学利用动物细胞融合技术首次获得单克隆抗体。已启用300L和1000L的培养罐分别用于生产单克隆抗体和灰色脊髓炎等疫苗。20世纪90年代国际上兴起了一种用活细胞作为治疗剂的“活细胞疗法”,主要是在体外繁殖患者的自体细胞,使之扩增或具有疗效物质,然后再注入到体内,该法对癌症白血病糖尿病烧伤艾滋病等都有潜在的治疗效果。

⑶供医学器官修复或移植的组织工程

运用细胞工程技术使人体残余器官的少量正常细胞在体外繁殖,从而获得患者所需要的、具有相同功能又不存在排斥反应的器官,供器官移植只需。例如,一些骨骼软骨血管皮肤都正在实验室培育,肝脏、胰脏、心脏乳房手指和耳朵等在实验室生长成形。

转基因动物的生物反应器

与传统动物细胞培养相比,转基因动物制药技术具有很高的效益,一头转基因动物就是一座天然的基因药物制造厂。1992年,上海医学遗传所培育携带人体蛋白基因的中国首例转基因试管牛。2000年,我国培育出转有人α抗胰蛋白酶基因的转基因山羊,可从转基因山羊奶中提取治疗慢性肺气肿先天性肺纤维化囊肿疾病的特效药物。

3.细胞工程在能源、环境保护等领域的应用

为了获得能分解利用纤维素水解物,并高效产生乙醇菌株,将利用纤维二糖能力强的Candida abtusa 和产乙醇率高的发酵接合糖酵母进行融合,获得的融合子不但以纤维二糖为唯一碳源,而且产乙醇能力高于双亲。

绿孢链霉菌TTA和西康氏链霉菌75viz进行融合,得到4株降解玉米杆纤维素能力比亲株高出155%~264% 。

通过电融合法对酿酒酵母和季也蒙假丝酵母进行融合,筛选出既能利用木糖又能利用纤维二糖生产乙醇的菌种,对纤维素再生资源的利用和减少环境污染具有重要意义。

植物组织培养的过程是

脱分化 再分化

离体的组织、器官、或细胞————愈伤组织————胚状体——植株

在脱分化和再分化的过程中都需要在培养基中添加适当比例的生长素细胞分裂素,以诱导细胞的脱分化和再分化。但两者的比例变化后,诱导的结果是不同的:当生长素含量高于细胞分裂素时,主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成(即有利于根的发生);当细胞分裂素含量高于生长素时,则主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成(即有利于芽的发生)。

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