流式细胞仪

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流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器,它只能测量一个细胞的诸如总核酸量,总蛋白量等指标,而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说,它的细节 分辨率为零。  

目录

流式细胞计的基本结构

流式细胞计主要由四部分组成。它们是:流动室和液流系统;激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统。图10-1为其结构示意图。

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流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细,是液流系统的心脏。样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振动。  

激光源和光学系统

经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯,其发射光谱大部分集中于300~400nm,很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强,约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550~650nm连续可调的激光,尤在590nm处转换效率最高,约可占到一半。为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定:d=4λf/πD。λ为激光波长;f为透镜焦距;D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC(Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素)发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开。  

光电管和检测系统

经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)最为常用。PMT的响应时间短,仅为ns数量级;光谱响应特性好,在200~900nm的光谱区,光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节 ,因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题,工作电压要十分稳定,工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W;最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理,并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT,因为光谱响应特性不同,不宜互换。也有用硅光电二极管的,它在强光下稳定性比PMT好。

从PMT输出的电信号仍然较弱,需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号,例DNA测量等。另一类是对数放大器,输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1~2个数量级;而且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。  

计算机和分析系统

经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的,也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的6~8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和分析,最后给出结果。除上述四个主要部分外,还备有电源及压缩气体等附加装置。  

流式细胞计的工作原理

下面分别简要介绍流式细胞计有关的参数测量、样品分选及数据处理等工作原理。  

参数测量原理

流式细胞计可同时进行多参数测量,信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的,所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时,受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线,散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关,因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射,因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变,其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关,还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中,常用的是两种散射方向的散射光测量:①前向角(即0角)散射(FSC);②侧向散射(SSC),又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来,前向角散射光的强度与细胞的大小有关,对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大;对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系;对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大,尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关,但它对细胞膜胞质核膜折射率更为敏感,也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中,仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时,可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分:①自发荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光;②特征荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号,在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中,对于结合水平不高的荧光抗体来说,如何提高信噪比是个关键。一般说来,细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素细胞色素等)的含量越高,自发荧光越强;培养细胞中死细胞/活细胞比例越高,自发荧光越强;细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是:①尽量选用较亮的荧光染料;②选用适宜的激光和滤片光学系统;③采用电子补偿电路,将自发荧光的本底贡献予以补偿。  

样品分选原理

流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是:由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴,根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中;其它液体被当作废液抽吸掉,某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度,d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度,可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V,或-150V;偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的,因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间,一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键,仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。

(50)数据处理原理:FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析,至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。

①数据显示:FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。

直方图是一维数据用昨最多的图形显示形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析,形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同,横座标可以是线性标度或对数标度,用“道数”来表示,实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵座标一般表示的是细胞的相对数。图10-2给出的是直方图形式。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。

二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横座标和纵座标分别为与细胞有关的两个独立参数,平面上每一个点表示同时具有相应座标植的细胞存在(图10-3)。可以由二维点图得到两个一维直方图,但是由于兼并现象存在,二维点图的信息量要大于二个维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维座标在图上只表现为一个点,这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。

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图10-2 直方图 图10-3 二维点图

二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数,即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的,因此等高线越密集则表示变化率越大,等高线越疏则表示变化平衡。图10-4给出了二维等高图的样式。

假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现,但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作,以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节 ,这无疑是有助于对数据进行分析的。图10-5为假三维图的示意图。

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图10-4 二维等高图 图10-5 假三维图

列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式,三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用ListMode中的特殊技术,开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如,“一调二”就是在一维图上调出二维图来;“二调一”就是从二维图中调出一维图来。图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。

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图10-6 从二维图设窗调出直方图示意

上面简要地介绍了几种数据显示形式,在实际应用中,可根据需要选择匹配,以便了解和获得尽可能多的有用信息。

②数据分析:数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组,方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时,可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据,则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设,即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单,只需要直观观测频数分布;也可能很复杂,要对两个或多个直方图逐道地进行比较。

逐点描图(或用手工,或用描图仪、计算机系统)是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上,不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这一点来看,非参数分析是参数分析的基础。

逐道比较工作量较大,但用直观法很容易发现明显的差异,特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性,要注意到对每组测量,都要有对照组,对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等,具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出,进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理,甚至对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的。

因为数据分析往往和结果解释关系十分密切,也就是说和生物学背景相关,因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。  

流式细胞计的技术参数

为了表征仪器性能,往往根据使用目的和要求而提出几个技术参数或指标来定量说明。对于流式细胞计常用的技术指标有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度、可分析测量参数等。  

荧光分辨率

强度一定的荧光在测量时是在一定道址上的一个正态分布的峰,荧光分辨率是指两相邻的峰可分辨的最小间隔。通常用变异系数(C.V值)来表示。C.V的定义式为:

C.V=σ/μ

式中,σ为标准偏差,μ是平均值。

在实际应用中,我们使用挖关系式σ=0.423FWHM;其中FWHM为峰在峰高一半处的峰宽值。目前仪器的荧光分辨率均优于2.0%。  

荧光灵敏度

反映仪器所能探测的最小荧光光强的大小。一般用荧光微球上所标可测出的FITC(fluorescein isothiocyanate 异硫氰基荧光素)的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。  

分析速度/分选速度

仪器每秒种可分析/分选的数目。一般分析速度为5000~10000;分选速度掌握在1000以下。  

样品浓度

主要给出仪器工作时样品浓度的适用范围。一般在1010细胞/ml的数量级。

其它技术参数尚多,不再一一介绍。  

流式细胞计的调试和使用

古语说:“工欲善其事,必先利其器”。要想很好地应用流式细胞分析和分选技术,必需先对仪器进行调试,使其处于良好的工作状态,并能正确使用仪器。下面简要介绍细胞计的调试项目及要点、使用的程序等等。  

调试和校准

流式细胞计在使用前,甚至在使用过程中都要精心进行调试,以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。

激光强度:除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外,还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。

液流速度:可通过操作台数字显示监督,调节 气体压力大小以获得稳定的液流速度。

测量区光路调节 :这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交,而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。

流式细胞术中所测得的量是相对值,因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定,这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能:仪器的准直调整和定量标度。标准样品应该稳定,有形成份形状应是大小比较一致球形,样品分散性能良好,且经济、容易获得。常用标准荧光微球作为非生物学标准样品,鸡血红细胞做为生物学标准样品。微球用树脂材料制作,或标有荧光素,或不标记荧光素。所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下:取3.8%枸橼酸肝素抗凝的鸡血(抗凝剂:鸡血=1:4),经PBS清洗3次,再用5~10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合,室温下振荡醛化24h,最后经PBS再清洗,贮4℃冰箱中备用。需要指出的是因为未经荧光染色,所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。  

仪器的操作和使用

①打开电源,对系统进行预热;

②打开气体阈,调节 压力,获得适宜的液流速度;开启光源冷却系统;

③在样品管中加入去离子水,冲洗液流的喷嘴系统;

④利用校准标准样品,调整仪器,使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上,0和90散射的荧光强度最强,并要求变异系数为最小;

⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等,在同样的工作条件下测量样品和对照样品;同时选择计算机屏上数据的显示方式,从而能直观掌握测量进程;

⑥样品测量完毕后,再用去离子水冲洗液流系统;

⑦因为实验数据已存入计算机硬盘(有的机器还备有光盘系统,存贮量更大),因此可关闭气体、测量装置,而单独使用计算机进行数据处理;

⑧将所需结果打印出来。  

操作和使用中的注意事项

1)光电倍增管要求稳定的工作条件,暴露的较强的光线下以后,需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作;另外还要注意磁屏蔽;

2)光源不得在短时间内(一般要1h左右)关上又打开;使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常;

3)液流系统必需随时保持液流畅通,避免气泡栓塞,所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒

4)注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等;

5)特别强度每次测量都需要对照组。

  

流式细胞仪的应用

1.分析细胞表面标志

2.分析细胞内抗原物质

3.分析细胞受体

4.分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量

5.分析免疫细胞的功能

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