临床生物化学/肾功能试验

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肾小球滤过功能检查

肾“清除”率是1928年Van Slyke制定的,表示肾脏在单位时间内(每分钟)将多少亳升血浆中的某物质清除出去。清除率对于了解肾脏各部位的功能很有帮助。以公式表示如下:

C=UV/P

C-清除率(ml/min)

V-每分钟尿量(ml/min)

U-尿中测定物质的浓度(mmol/L)

P-血中测定物质的浓度(mmol/L)

由于此公式计算得到的清除值是被测者个体的结果,但个体大小、高矮、胖瘦、年龄等差异很大,必须标准化,以标准的体表面积1.78m2校正。A代表个体的体表面积。

校正后的清除值 C=UV/P×1.73/A

体表面积的计算:

logA(m2)=0.425log[体重kg]+0.725log[身高cm]-2.144

利用清除率分别测定肾小球滤过率肾血流量肾小管对各物质的重吸收和分泌作用(表11-1)。

血浆中所含某一物质小部分经肾小球滤过,不被肾小管重吸收,而且血中剩余部分又可全部由肾小管分泌,使这一物质通过肾后几乎全部排出,那么它的清除率既代表肾血浆流量(RPF),又可反映肾小管的分泌功能,如对氨基马尿酸、碘锐特、酚红和青霉素等。

若另一物质能全部经肾小球滤过,肾小管对其不吸收、不排泄,则其清除率可反映肾小球的滤过率(glomerular filtration rate,GFR),如菊粉肌酐等。

某物质经肾小球滤过后,完全被肾小管重吸收,其清除值等于0,例如葡萄糖。在血浆浓度接近肾糖阈时,利用清除值公式,可计算出滤液中被重吸收的葡萄糖量即肾小管葡萄糖最大重吸收量(TMG),用以反映近端肾小管的重吸收功能。

表11-1 肾清除试验及其临床意义

肾脏对物质的清除方式 物 质 清除值临床意义
从肾小球滤过,肾小管对它即不重吸收又不分泌 肌酐、菊粉
甘露醇硫代硫酸钠
反映肾小球滤过功能
小部分从肾小球滤过大部分从肾小管分泌 对氨基马尿酸酚红、青霉素 反映肾小管分泌功能代表肾血流量
经肾小球滤过后,相当一部分被肾小管重吸收 尿酸 尿量多少影响重吸收,尿量减少,尿素重吸收增加,消除值变异较大,不是理想的肾功能试验
经肾小球滤过后,在近曲小管几乎完全被重吸收,远曲小管可以被分泌 钾离子 清除值无意义
经肾小球滤过后大部分被肾小管重吸收 各种电解质
氨基酸
清除值很低,C<10ml/min
经肾小球滤过后完全被肾小管重吸收 葡萄糖 清除值为0

⒈肾小球滤过率

⑴菊粉清除率测定:菊粉(inulin)是一种植物多糖,相对分子量为5200左右,完全由肾小球滤过,不被肾小管重吸收或分泌,是理想的测定GFR的物质,其清除率(125ml/min)可准确反映肾小球滤过率。其它类似的物质有肌酐、甘露醇、硫代硫酸钠和51Cr-EDTA等,在这些物质中菊粉最为适合,但菊粉是外源性物质,测定方法麻烦。临床上多测定内生肌酐清除率,它具有测定方法简单的优点。

⑵内生肌酐清除率(Ccr):人体肌肉以每分钟1mg速度将肌酐排入血中,血浆肌酐浓度比较稳定,受外界因素如蛋白质的摄入等影响较小。从肾小球滤过后,不被肾小管重吸收和分泌,只要同时测定血和尿中肌酐浓度,并记录每分钟尿量就可计算出内生肌酐清除率。

每分钟肌酐清除率

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参考值:根据体表面积校正后,范围为80-120ml/min/1.73m2。

在严格控制条件下,尿中肌酐排泄量相当稳定,故可将24小时法改用4小时法测定Ccr。

测定内生肌酐清除率来估计肾小球滤过率从理论上说不如菊粉,因为当血中肌酐明显增高时,可有一小部分肌酐由肾小管分泌到尿中。此时测出的肌酐清除率高于实际的肾小球滤过率。又由于血浆中肌酐浓度较低,常用的碱性苦味酸试剂显色法(Jaffe反应)有其它干扰因素存在,常使血浆测定值偏高,而使清除值低于菊粉清除值。

肾小球病变时,一部分肾小球破坏,滤过面积减少,肾小球滤过率可明显下降,但由于肾脏有强大的贮备能力,余下的肾单位仍能排出日常机体所产生的尿素和肌酐等代谢产物,血浆中这些物质浓度变化不大。如图11-2说明肾小球滤过率与血中尿素、肌酐浓度变化间的关系。

肾小球滤过率与血肌酐、尿素浓度的关系


图11-2 肾小球滤过率与血肌酐、尿素浓度的关系

从图11-2可见,只有当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时,血浆中尿素及肌酐浓度才出现增高,当肌酐高达618.8-707.2μmol/L时,肾小球滤过率已明显下降到仅及正常的10%。说明测定肾小球滤过率比测定血浆尿素和肌酐含量更为灵敏可靠。

⒉血肌酐和尿素浓度测定 血肌酐(serumcreatinine,Scr)和血尿素(bloodureanitrogen,BUN)的浓度取决于机体氮的分解代谢与肾脏的排泄能力。在摄入食物及体内分解代谢比较稳定的情况下,其血浓度取决于肾排泄能力,因此,Scr和BUN浓度在一定程度上可反映肾小球滤过率功能的损害程度,是常用的肾功能指标。

⑴尿素的测定方法可分为两大类:一类直接法,尿素直接和某试剂作用,测定其产物,最常见的为二乙酰一肟法;另一类是尿素酶法,用尿素酶将尿素变成氨,然后用不同的方法测定氨。

1)尿素酶法(直接法):尿素酶法利用尿素酶催化尿素水解生成铵盐,铵盐可用纳氏试剂直接显色、酚-次氯酸盐显色或酶偶联反应显色。

尿素测定目前多采用尿素酶偶联法:用尿素酶分解尿素产生氨,氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH氧化为NAD+时,通过340nm吸光度的降低值可计算出尿素含量。

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此反应是目前自动生化分析仪上常用的测定原理。此外,尿素酶水解尿素产生氨的速率,也可用电导的方法进行测定,其电导的增加与氨离子浓度有关,反应只需要很短的时间,适用于自动分析仪。

2)酚-次氯酸盐显色法:尿素酶水解尿素生成氨和酚及次氯酸盐,在碱性环境中作用形成对-醌氯亚胺,亚硝基铁氰化钠催化此反应:

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对-醌氯亚胺同另一分子的酚作用,形成吲哚酚,它在碱性溶液中产生蓝色的解离型吲哚酚:

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此反应敏感,血清用量少(10μl),无需蛋白沉淀,一般用于手工操作测定中。

3)纳氏试剂显色法:尿素经尿素酶作用后生成氨,氨可与纳氏试剂(HgI2.2KI的强碱溶液)作用,生成棕黄色的碘化双汞铵。

尿素酶法的优点是反应专一,特异性强,不受尿素类似物的影响,缺点是操作费时,且受体液中氨的影响。

⑵二乙酰一肟法(直接法):尿素可与二乙酰作用,在强酸加热的条件下,生成粉红色的二嗪化合物(Fearom反应),在540nm比色,其颜色强度与尿素含量成正比。二乙酰不稳定,用二乙酰一肟代替,后者遇酸水解成二乙酰。

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试剂中加入Fe3+或Cd2+及硫氨脲,可提高灵敏度,增加显色稳定性,其中Fe3+和Cd2+有氧化作用,还能消除羟胺的干扰作用。提高酸的浓度可增加灵敏度。二乙酰一肟与尿素的反应不是专一的,与瓜氨酸也有显色。本法灵敏、简单,产生的颜色稳定,缺点是加热时有异味释放,一般临床已很少使用此方法。

尿素测定用血清或血浆,体液中尿素的浓度常用尿素中含有的氮来表示,称为尿素氮。如欲换算成尿素,可根据60g 尿素含有28g氮计算,即1g尿素相当于0.467g尿素氮,或是1g尿素氮相当于2.14g尿素。

正常参考值:血清尿素氮为2.8-7.1mmol/L,相当于尿素1.8-6.8mmol/L。

⑶肌酐与碱性苦味酸试剂反应产生红色(Jaffe反应),仍是目前常用的测定方法。为提高其准确性现已改为动力学测定法。

1)Jaffe反应法:测定肌酐最常用的方法是尿、血清中的肌酐与苦味酸盐作用,生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高,维生素C丙酮酸、丙酮、葡萄糖、乙酰醋酸果糖、氨基马尿酸、蛋白质、胍基醋酸酰胺及许多化合物也能与碱性苦味酸盐生成红色。这些不是肌酐而能起反应的物质称为假肌酐,相当数量的假肌酐存在于红细胞中,故在测定血液肌酐时用血清和血浆较好。

为去除假肌酐的影响,现在常用速率法来测定血肌酐。速率法亦称动力学方法,它是根据肌酐与碱性苦味酸形成复合物的速度与假肌酐不同,且肌酐的反应速度与浓度成正比的原理。如乙酰乙酸在20s内已与碱性苦味酸反应完成,其他多数干扰物则在80s后才与苦味酸有较快的反应,而20-80s之间主要是肌酐的反应。因此,血清与苦味酸混合后,分别读取510nm在20s及80s时的吸光度Ao和At,At-Ao除以间隔时间的值与肌酐浓度成正比,借标准液与样品同样测定即可求取样品中的肌酐量。现在速率法逐渐成为常规分析法,因为它不需去蛋白,方法简单、快速,可自动扣除血清及试剂空白吸光度。

2)酶联法:肌酐经肌酐水合酶催化生成肌酸,肌酸与肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶偶联反应,使NADH变成NAD+,测量在340nm处吸光度的降低,其降低程度与肌酐含量呈正比例,反应式如下:

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此法特异性高,标本不需去蛋白,特别适用于自动分析。但工具酶过多、价格昂贵。

正常参考值:血浆肌酐44-133μmol/L。

血尿素浓度除受肾功能影响外,还受到蛋白质分解代谢引起的变化,如高蛋白饮食、胃肠道出血、口服类固醇激素等都可使血尿素浓度增高。而肌酐摄入、生成量恒定,故血肌酐测定较血尿素测定更能准确地反映肾小球功能,但反应较迟钝。

肾功能不全代偿期可见BUN轻度增高(>7.0mmol/L),肌酐可不增高或轻度增高;肾功能衰竭失代偿期,BUN中度增高(17.9-21.4mmol/L),肌酐也中度增高(442.0μmol/L);尿毒症时BUN>21.4mmol/L,为尿毒症诊断指标之一,肌酐可达1.8mmol/L。

血清尿酸(serum uricacid,SUA)尿酸是嘌呤类的终末产物,血尿酸主要从肾脏排出,肾功能减退时SUA增高。尿酸从肾小球滤过后在肾小管中重吸收和分泌,最后排出滤过量的8%,在严重衰竭时肾小管分泌大增,可达滤过量的85%被排出,慢性尿毒症时SUA的增高程度不明显。

尿酸测定方法可分为两大类:磷钨酸还原法和尿酸酶法,目前以尿酸酶法为主。

⑴磷钨酸法:是利用在碱性环境中尿酸具有还原性,无蛋白血滤液中的尿酸可使磷钨酸还原生成蓝色的钨蓝,可进行比色测定,反应如下:

尿酸+磷钨酸→尿囊素+CO2+钨蓝

此法的不足之处是特异性不高,显色褪色速率变化不定,灵敏度低。

⑵尿酸酶法:尿酸酶测定方法可分为三种类型:

1)紫外分光法:尿酸在282-292nm处有特异吸收峰,当其经尿酸酶作用后,产物在此波长范围无吸收峰,测量酶作用前后吸光度之差,经标准品、测定样品同时处理,可计算尿酸含量。该法灵敏度高,特异性强,其它物质无干扰,可用血清直接测定,不需沉淀蛋白,易于自动化,具有简单、快速的优点。

2)酶联比色法:尿酸经尿酸酶作用生成的H2O2,可用偶联的过氧化物酶(POD)使H2O2氧化还原色素原,成为氧化型而显色,用酚和4-氨基安替比林作生色原。反应如下:

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反应生成的红色醌亚类化合物,在500nm处有最大吸光度,吸光度的增加与样品中酸含量呈正比,可进行比色测定。此法敏感,反应所产生的颜色比用酚作色素原时产生的颜色强度大4倍,可用血清直接测定。

3)酶联-紫外分光法:尿酸酶将尿酸氧化时生成的H2O2的存在下同乙醇作用生成乙醛,后者被偶联的醛脱氢酶(ALDH)进一步氧化生成乙酸,伴随着NAD+变成NADH,在340nm测定由NAD+还原产生的光吸收增加与样品中尿酸含量成正比。反应式如下:

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此反应第一步是特异的,但后面的氧化还原反应易受干扰,因体内有许多脱氢酶反应,亦可氧化内源性底物而伴有NAD+还原生成NADH,导致结果偏高。除以上方法外,固相酶技术的发展使测定更简单,更易自动化。尿酸酶的固相化有以下几种类型:①固相尿酸酶与氧电极相联,测定尿酸氧化时的耗氧量;②固相尿酸酶及过氧化物酶与显色法结合;③夹心固相酶-荧光法,使产生的H2O2与对羟基苯乙酸反应产生荧光,此法具有酶反应的特异性及荧光法的灵敏度。

正常参考值:血尿酸:男性148.7-416.4μmol/L,女性89.2-356.9mol/L.

㈡肾血流量测定

测定对氨基马尿酸(PAH)清除率或碘锐特清除率均可反映肾血流量.对氨基马尿酸(PAH)主要由近端小管分泌排出.当血浆中PAH浓度很低时流经肾脏,90%从肾脏清除而排入尿中,即流经肾脏的PAH大部分被清除.PAH清除率相当于流经肾脏的血浆量,称为有效肾血浆流量(ERPF)。PAH为外源性物质,操作复杂,临床上多不采用。放射性核素同位素)肾图能比较敏感地反映肾的血浆流量,目前临床上将其列为肾功能的常规检查。

㈢肾小管功能检查

肾小管的功能比较多,除了具有强大的再吸收水分与一些物质的能力外,还具有选择分泌与排泄一些物质的能力。到目前还没有理想的肾功能试验适用于临床。生理研究中的肾小管葡萄糖最高再吸收率(TmG)和对氨基马尿酸最大排泄率(TmPAH),可较好地代表肾小管再吸收与排泄的功能,但操作麻烦,不适合临床应用,多以尿液浓缩-稀释试验和酚红排泄试验作为肾小管的功能试验。近年来尿中酶的测定和自由水清除值等的测定逐步使肾小管功能试验简单、灵敏、快速,更适用于临床。

⒈近端小管功能检查 酚红排泄率可作为判断近端小管排泄功能的粗略指标。酚红注入体内后,94%由近端小管上皮细胞主动排泄,从尿液排出。由于酚红排泄试验受肾血流量及其它肾外因素影响较大,对肾小管功能敏感不高,故目前基本不用。以测定尿β2-微球蛋白溶菌酶等估计近端小管功能。

⒉肾浓缩稀释试验 肾浓缩和稀释尿液功能主要在远端小管和集合管进行。在日常或特定饮食条件下观察病人尿量和尿比重的变化,称为浓缩稀释试验,作为判断远端小管功能的指标。(以上二试验在临床检验中已详尽叙述,本章略。)

尿渗透压测定 液体的渗透压是由溶液中溶质的毫摩尔浓度决定的,尿液渗透压反映尿液中溶质的摩尔数。尿比重和尿渗透压都能反映尿中溶质的含量,但尿比重易受溶质微粒大小和性质的影响,如蛋白质、葡萄糖等均可使尿比重增高;而尿渗透压则反映尿中各种溶质微粒的总数目,而与溶质分子相对重量、微粒体积大小无关,因而测定尿渗透压较测定尿比重更好,更能反映肾浓缩和稀释能力。

目前多采用尿液冰点下降法测定渗透压,也可用蒸气压渗透压计算法测定。溶液的渗透压增加,使其冰点降低。以纯水的冰点0℃为标准,任何溶液的冰点都比纯水为低,均为负值。冰点愈低,负值愈大,表明溶液中的渗透浓度越大。1渗量的溶质可使1kg水的冰点下降1.858℃,因此溶质渗透压等于冰点下降数除以1.858。

渗透压(Osm/kgH2O)=测得溶液冰点下降度(0C)/1.858

测定尿渗透压(Uosm)的方法有三种:①直接测定尿渗透压;②测定尿、血浆渗透压(Posm)的比值;③自由水清除率。

正常尿渗透压为600-1000 Osm/kg H2O。

尿渗透压和血浆渗透压相比,当尿渗透压高于血浆渗透压时,表示尿已浓缩,称为高渗尿;低于血浆渗透压表示已稀释,称为低渗尿;若与血浆渗透压相等为等渗尿,反映肾脏浓缩功能严重损害。

⒋自由水清除率 自由水清除值指单位时间内使尿液达到等渗,而应从尿中减去或加入的纯水量。在尿浓缩时,排出的尿量等于渗透尿量减去被总吸收的纯水量;在尿稀释时,排出的尿量等于等渗透尿量加上血浆中清除的纯水量。等渗尿量实际上就是渗透性溶质清除率,又称渗量清除率(Cosm)。它表示单位时间内肾脏能够将多少血浆中的渗透性溶质清除出去。

Cosm=Uosm/Posm×V(单位时间尿量)

由于V=Cosm+CH2O,因此CH2O的计算公式是:

CH2O=(l/Uosm/Posm)×V

自由水清除率正值代表肾稀释能力,负值代表肾脏浓缩能力;若CH2O等于或接近于0,则表示肾不能浓缩和稀释尿液,是肾功能严重损害的表现。因此,进行尿液浓缩试验时,自由水清除率的正值变小而接近于0,表示肾稀释功能受损,正常人常为-25-100ml/h。因在急性肾功能衰竭早期CH2O趋于0,CH2O呈现负值大小可反映肾功能恢复的程度,所以此测定对急性肾功能衰竭的早期诊断及病情变化有一定价值。

⒌肾小管对尿液的酸碱调节功能——H+总排泄量测定 正常饮食情况下,每天代谢产生50-100ml非挥发性酸,并从尿液中排出,主要经过肾小管分泌。若这么多酸都以游离的H+排除,则尿液的pH应小于2,但实际上正常尿液的pH在5-6之间,因此大部分H+是被缓冲后排出的。

肾小管以三种方式排酸:

⑴直接排H+,这部分可用pH计进行测定。

⑵和磷酸根、硫酸根及其它有机化合物结合。如HPO43-+H+→H2PO42-,pH4.5时,尿中磷酸盐几乎全部以H2PO42-存在,这部分酸加上游离H+可通过酸碱滴定来测定,称为可滴定酸度(UTA)。

⑶以NH4+形式排出,NH3在肾小管腔中与H+结合为NH4+排出体外。假定尿中无HCO3-排出,则H+总排泄量(UH)为:UH=UTA+UNH4+;当尿中有HCO3-排泄时,则机体每排泄1mmol HCO3-,必回收1mmol H+。所以肾的H+总排泄量应为:UH=UTA+UNH4--HCO3-在肾脏某些疾病时,肾小管排酸能力可能出现障碍,血液中有磷酸盐、硫酸盐、有机酸滞留,导致代谢性肾性酸中毒,主要见于各型原发性肾小管酸中毒症。

⒍尿钠的测定 尿钠浓度可作为估计肾小管坏死程度的指标。尿钠排泄量多少取决于胞外液量及肾小管重吸收的变化,在鉴别急性肾功能衰竭和肾前性氮质血症时有意义。肾前性氮质血症是由于肾血流量灌注不足引起的肾功能损害,若缺血严重或持续时间延长(超过2小时),则可引起急性肾小管坏死,是急性肾功能衰竭的前奏曲。在急性肾衰时,肾小管功能受损,不能很好地重吸收钠,故尿钠浓度>40mmol/L;而肾前性氮质血症的肾功能没有损坏,由于血容量不足,肾小管最大限度地重吸收钠,以维持血容量,故尿钠浓度<20mmol/L;若尿钠在20-40mmol/L之间,则表明病人正在由肾前性氮质血症向急性肾衰发展。

滤过钠排泄分数(FeNa)对鉴别肾前性氮质血症和急性肾衰有特别意义。以尿钠浓度表示肾小管功能状况不正确的理由是易理解的。尿钠浓度与自由水清除值呈反比,而醛固酮抗利尿激素可使尿钠浓度向相反方向转变。FeNa则不受上述因素影响,故能正确地反映肾小管的功能。FeNa的定义为肾小球滤过的钠经肾小管重吸收后,由肾排出的百分率。

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尿钠和血钠的单位为mmol/L,尿肌酐和血肌酐单位为μmol/L

尿标本、血标本应为同一时间采集的。在急性肾衰时,FeNa>1(主要是根据急性肾衰时,尿钠浓度增高和尿肌酐/血肌酐比值下降的原理)。肾前性氮质血症FeNa<1。

32 蛋白尿 | 早期肾损伤的生化诊断 32
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