酶联免疫吸附试验

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酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA) 利用抗原抗体之间专一性键结之特性,对检体进行检测;由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原抗体仍可具有免疫活性,因此设计其键结机制后,配合酵素呈色反应,即可显示特定抗原或抗体是否存在,并可利用呈色之深浅进行定量分析。

目录

历史与展望

二十几年来,免疫学分析方法发展很快,特别是在使用标记了的抗原抗体的分析技术以后,使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光(IFA)和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后,在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用,一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应,产生了放大作用,使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来,这种技术被称为酶联免疫吸附试验法(Enzyme—Linked Immunosorbent Assay,ELISA),本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后,现已引起广泛重视。

ELISA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,根据已经使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大,可概括四个方面:

  1. 免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
  2. 研究抗酶抗体的合成。
  3. 显现微量的免疫沉淀反应。
  4. 定量检测体液中抗原或抗体成份。

基本原理

酶联免疫法原理

ELISA的基本原理有三条:

(1)抗原抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;

(2)抗原或抗体可通过共价键连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;

(3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。

种类

由于ELISA法一方面是建立在抗原抗体免疫学反应的基础上,因而,具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物,它可以催化底物分子发生反应,产生放大作用,正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此,ELISA法是一种既敏感又特异的方法。常用的ELISA有以下两个方面。

测定抗原

主要有:

1、竞争法(Competition method):本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面,我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程,称为包被(Coated),也可叫做致敏。经洗涤后分成两组:一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液,而另一组只加酶标记抗原,再经孵育洗涤后加底物显色,这两组底物降解量之差,即为我们所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可,因此,对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快,因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。

2、双抗体夹心法:本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体,经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合,经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定,底物降解的量即为欲测抗原的量。这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位,因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用,而另一端则要与标记特异性抗体作用。因此,不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。

测定抗体

所用的方法称为间接法,也是目前最常用的方法。间接法首先用抗原包被于固相载体,这些包被的抗原必须是可溶性的,或者至少是极微小的颗粒,经洗涤,加入含有被测抗体之标本,再经孵育洗涤后,加入酶标记抗抗体,(对人的标本来说即加酶标抗人球蛋白IgG、IgM),再经孵育洗涤后,加底物显色,底物降解的量,即为欲测抗体的量,其结果可用目测或用分光光度计定量测定,本法用不同种抗原包被固相载体后,只要用一种酶标记抗人球蛋白,即可作多种人的传染病寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断。如用酶标记抗人IgM,则可用于早期诊断。

应用

ELISA应用的范围很广,而且正在不断地扩大,原则上ELISA可用于检测一切抗原抗体半抗原,可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。

酶免疫试验(EIA)结合光学显微镜电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究,用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此,它和生物化学免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。

检查抗原和半抗原方面:在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素黄体素胰岛素皮质醇促甲状腺素孕酮等,其敏感性与RIA相当,在血液学方面可用于检查凝固因子(如第Ⅷ凝固因子)、红细胞抗原及结合球蛋白(Hapto Globin)等,在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白(AFP)癌胚抗原(CEA),对前者的敏感性已达到与放射免疫试验相当的水平,但对CEA检查的敏感性较低,目前尚不能用于常规诊断,在传染病的诊断方面正在日益扩大,其中最满意的是用于检查乙型肝炎表面抗原。国内外已有ELISA检测的商品供应。

尚有用于检查霍乱弧菌大肠肝菌绿脓杆菌破伤风梭菌毒素;脑膜炎球菌及淋球菌抗原;检查免疫抑制病人中常见的白色念殊菌抗原,检查病人或病兽的粪便中的轮状病毒,自病人标本中检查甲肝病毒疱疹病毒麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨细胞病毒等。还可用于植物组织浆液中检查植物病毒。此外尚试用于测钩体抗原及血吸虫病的循环抗原等。在免疫化学方面可用于检测白蛋白,免疫球蛋白的各种组份,也可用于检测补体成份,如:ciq,还能用于检测蛇毒。

检查抗体方面:用ELISA间接法检查抗体,已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断,亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面,它用于对疟原虫阿米巴利日曼原虫锥虫血吸虫囊虫弓浆虫肺吸虫肝吸虫血丝虫旋毛虫病等血清学诊断,这对人医和兽医都很重要。在病原微生物方面已用于检查链球菌沙门氏菌布氏杆菌结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体,还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体,可作诊断。对立克次氏体还可用以鉴别密切有关的种属。也有用于检查鹦鹉热衣原体抗体的报导。试用于病毒抗体检查报告的有:流感病毒腮腺炎病毒麻疹风疹轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等,其敏感性都超过目前常用的检查方法。此外,还可用于鉴定病毒型别,例如疱疹病毒。如能进一步改进方法用于检查特异性IgM,可以作为早期诊断以及了解体内有关抗原的清除情况。在免疫性疾病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断,例如检测各种过敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体,红斑性痕疮抗体等等。在卫生学方面,可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。

局限性

从以上的简单介绍中可以看出,ELISA法由于本身所具备的优越性,是一项很有发展前途的血清学诊断方法,而且应用的领域也越来越广泛。但是我们认为ELISA不是万应良方,用它来代替一切,这是不当的。因为ELISA法还有局限性:

  1. 由于ELISA所用的抗原大部分还是混合的可溶性抗原,所以对同一微生物寄生虫或其他物质不同部位的抗原还没有分开。
  2. 内源性过氧化酶的普遍存在,如人脑组织中,呼吸道分泌物的炎症细胞中及某些病毒的组织培养中均有内源性过氧化物酶的活力,常不易除去,如果用某些方法除去时,则病毒的抗原性亦受到破坏,对于用ELISA检测不利。
  3. 对ELISA法的非特异性评价的资料尚不够完善,因此,对出现一些非特异性反应的时候,往往不易解释。
  4. 固相载体的质量常不统一,主要是原料及制备工艺还不一致,致使不同批号的固相载体有时本底值较高,有时吸附性能很差,影响试验结果。
  5. 试剂不统一,现在处于“八仙过海,各显神通”,标准还不能统一。

参看

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酶联免疫吸附试验及其应用.鲍行豪 

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