临床生物化学/核酸的分离与纯化

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核酸存在于多种细胞,如病毒细菌寄生虫、动植物细胞;多种标本中,如血液、组织、唾液、尿液等其它来源的标本。因此分离方法复杂而多样。又因各种DNARNA的丰度差异,各种分析方法对核酸的纯度与量的要求有差异,因此在实验前应对采用的方法有所了解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上,利用苯酚等有机溶剂抽提(核酸溶于缓冲液,即水相),分离,纯化;乙醇丙酮等有机溶剂沉淀,收获。溶解细胞的方法因标本不同而不同,有用SDS加NaOH,有用蛋白酶,有的用超声波破碎等方法,苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的。实验上生物标本中含量最多的就是蛋白质。为了除去分离过程中残留的有机溶剂,常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸,通过离心回收核酸,然后用70%-80%乙醇洗涤沉淀,除去多余的盐,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。为了得到纯的核酸可用蛋白酶除去蛋白,用RNA酶除去RNA,得到纯的DNA,用DNA酶除去DNA而获得RNA。目前开发了许多商品化的核酸分离柱,可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA。其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用需分离核酸的特点与其特异性结合达到分离、回收的目的。

(一)质粒的分离与纯化

含质粒的E. Coli cells经LB培养液250ml扩大培养,倒入50ml离心管,4℃,3000rpm,离心15分钟。弃去上清液。(弃去液丢弃前应作消毒处理,以免污染环境)。加lysis buffer(50mmol/L Glucose,10mmol/l EDTA,25mmol/l Tris-HCl,pH8.0)1-2ml使之悬浮。放置室温5分钟,加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液(1mol/l NaOH 8ml,20%SDs2ml,蒸馏水30ml)上下摇匀,置冰水浴5分钟。禁用混匀器,以免DNA分子断裂),加2.5mol/L醋酸钾缓冲液(pH4.8)2.6-5.2ml,上下摇匀,冰浴5分钟。4℃,3000rpm,离心15分钟。沉淀蛋白质。取上清液,加无水乙醇12-24ml(上清液的二倍)放室温15分钟后,10000rpm离心,弃上清液。加约为沉淀物体积的0.4倍TE(10mmol/lTris-Hcl pH8.0,10mmol/l EDTA)溶解沉淀后,加0.2倍的7.5mol/L醋酸铵。可用混匀器混匀,置冰浴10分钟。4℃,10000rpm离心5min,弃上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/lTris-HCl pH7.5,10mmol/l EDTA缓冲液,1/10体积的5mg/ml RNase,37℃,30分钟保温。加等量的phenol(酚)/CIAA(480ml氯仿,20ml异戊醇),混匀。4℃,10000rpm,离心5分钟。取上层液加酚/CIAA重复一次。取上层液加1/10体积5mol/l NaCl和2倍无水乙醇,―20℃过夜或―70℃2小时以上。4℃,10000rpm,离心10分钟,弃上清液。加80%乙醇不摇动,直接10000rpm离心,弃上清液,真空干燥。加适量(约200μl)TE溶解。测定含量后备用。

(二)重组质粒中目的基因的分离与纯化

先取少量纯化的重组质粒,用限制性内切酶切出目的基因,经电泳分离,确认。以200μl含2mg DNA(重组质粒)为例:取10μl含100μg DNA,加90μl TE。按1μgDNA加2-5U限制性内切酶,1/10体积缓冲液,1-2小时保温。缓冲液种类和酶反应温度因内切酶种类而异。1/10体积3mol/l NaAc,2倍无水乙醇,-70℃,2小时(-20℃过夜),10000rpm,10分钟离心,弃上清液(乙醇沉淀)。适量TE溶解沉淀(切断的DNA质粒与目的基因混合物),电泳分离(用相应分子量DNA标准同时电泳),在紫外光下观察结果,与标准DNA分子量比较,确认目的基因和内切酶的切割效果。

⒈电泳条件:

凝胶制备: 1%琼脂糖凝胶 agarose(mg) X50TAE(ml) EB(溴化乙锭μl)
(agarose) 1000 2.0 4.0
总体积(ml)
100
胶浓度(%): 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
DNA长度(kb): 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
电泳缓冲液: X50TAE(ml) EB(μl) 总体积(ml)
20 30 1000

X50TAE:Trismabase 54g;乙酸57.1ml;0.5m EDTApH8.0 20ml;蒸馏水至1000ml。

EB:10mg/mlethidium bromide。(EB有致癌性,操作应小心)。

经电泳确认后,取适量DNA(重组质粒)同上条件切开,用1.5%低熔点(<65℃熔解)琼脂糖凝胶,电泳分离。在紫外光下,切出含目的基因区带(凝胶),放入离心管中,提取纯化。

⒉从低熔点凝胶提取,纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE(10mmol/lTris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA),置65℃水浴5分钟保温,使凝胶完全溶解。待放至室温,加等量酚(TE饱和,TE封在上层,取下层酚),轻轻混匀(不用混匀),12000rpm,3分钟离心。反复1-2次。取上层液,加0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇,进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解,测定含量,备用(可用于目的基因结构分析,探针制备等)。除低熔点凝胶回收法外,如用一般凝胶可用透析带短暂电泳,离心管低部加玻璃棉,高速离心等方法回收DNA片段。

(三)标本DNA的分离与纯化

用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl10mmol/l pH7.4,EDTa 1mmol/L pH8.0)调整细胞为2×107个(组织应切碎置液氮冰冻,高速搅切成粉末后,加入缓冲液)。加1/10-1/20体积(V)10mg/ml蛋白酶(Sigma Ⅷ型),1/20v 10%SDS,37℃2小时。加等量酚/3xNTE(3xNTE上封)混匀(至少7分钟)。4℃,3000rpm,10分钟。取上清液,加2mlTE(Tris-HCl 10mmol/L pH7.5,EDTa 1mmol/L pH8.0),充分混匀。乙醇沉淀。2mlTE溶解沉淀。加1/30xNTE,蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重复2-4步骤。测定含量。

(四)样品RNA的分离,纯化

含106细胞液加等量纯化溶液[4mol/L胍基硫氰酸盐,25mmol/L柠檬酸pH7.0,0.5%肌氨酸(sarcosyl),0.1mol/l 2-巯基乙醇]。总体积为细胞沉淀4-5倍,混匀。加0.1体积2ml/L乙酸钠(pH4.1),1体积酚(重蒸水上封),0.2体积CIAA,混匀器剧烈混合10秒钟。冰水浴15分钟。10000xg4℃,20分钟。离心(不用刹车)。小心取出上清液。加等量丙酮(或2倍乙醇),-20℃,60分钟以上。10000xg,4℃,20分钟离心。弃上清液。用1.5ml离心管约加0.3ml纯化溶液,重复3)步骤,离心10分钟,弃上清液。加75%乙醇,10000xg,4℃,10分钟离心。弃上清液。真空干燥15分钟,备用。

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