临床生物化学/探针制备

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探针制备就是目的基因的标记,核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法等。标记物质有放射性元素(如32P等)和非放射性物质(如生物素地高辛等)。32P是最常用的核苷酸标记同位素,被标记的dNTP本身就带有磷酸基团,便于标记,特点是比活性高,可达9000Ci/mmol;发射的β射线能量高,可达1.70MeV,用它标记的探针自显影时间短,灵敏度高。32P的半寿期为14天,应随标随用,一般标记后,在一周内使用,它虽带来不便,但给使用后废弃物处理减轻了压力。使用32P标记物应注意防护,操作时应有1-1.5cm厚聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃隔离保护,避免直接照射。操作人员胸前应佩带个人计量器,定期检测。结束实验后,应用专用探测器(盖革-米勒检测器),检查工作区域、手、衣服等,以免污染发生。其它同位素标记物,同样应注意放射线防护。

放射性标记有酶标和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似,只是被标记的核酸代替了被标记的抗体,事实上被标记的抗体也称为探针,阅读文献时应加以注意。现有许多商品是生物素(biotin)、地高辛标记的,如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。血凝素(avidin)与生物素有非常高的亲和性,当血凝素标记上过氧化物酶碱性磷酸酶(血凝素-酶),经杂交反应最终形成:探针-生物素-血凝素-酶复合物(ABC法)。酶催化底物显色,观察结果。与一般的酶反应底物不同,ABC法底物显色后为不溶物,以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差、成本高,但便于运输保存,灵敏度与放射物标记相当。化学物标记有的也是利用相应酶标抗体形成特异复合物,与上述方法相当,有的则可自发光。化学标记法简单、成本低,但灵敏度相对较低。(表18-1)

表18-1 探针标记及特性

标记物 检测方法 特点
32P β射线,自显影 灵敏度最高,半寿期14天,放射强度1.7MeV
35S β射线,自显影 灵敏度高,分辨率好,半寿期87天,0.17MeV
3H β射线,自显影 低敏度高,分辨率高,半寿期12年,0.01MeV
125I γ射线,自显影 灵敏度高,分辨率高,半寿期60天,0.04MeV
生物素 酶标血凝素,显色 灵敏度好,避免有内源性生物素标本
地高辛 酶标地高辛配体,显色 灵敏度好,分辨率一般
T-T二聚体 酶标抗二聚体抗体,显色 灵敏度好,紫外照射形成二聚体而标记
BrdU 酶标抗BrdU抗体,显色 灵敏度好,细菌内含质粒复制掺入
铕-补骨脂素 荧光 灵敏度一般

缺口平移标记法先由DNase Ⅰ在DNA双链上切出随机切口,DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸和3′端修复加入被标记核苷酸同时进行,切口平行推移,可均一标记DNA链。(图18-4、5)

缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修复DNA的功能,用于大分子DNA标记(>1000bp最好),单链DNARNA不能用该法标记。随机引物法具有上述优点,可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记,标记均匀,标记率高,但不能标记环状DNA。利用末端转移酶可进行“尾标”,尾标适用于寡核苷酸探针标记,用于大分子核酸标记因尾巴短而标记比活性降低。尾标不能用dTTP标记,因mRNA的多聚(A)尾而影响杂交特异性。寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变检测,该探针可用核酸合成仪人工合成。克隆探针一般较长,特异性

DNA随机引物标记法


图18-5 DNA随机引物标记法

好,标记量大,杂交检出信号强。合成探针长度短,一般在20-50核苷酸之间,过长合成成本高,且易出现聚合酶合成错误,杂交时间长。太短则特异性下降。合成探针设计还应注意碱基组成G≡C含40%-60%,一种碱基连续重复不超过4个,以免非特异性杂交产生。还要注意探针自身序列内应无互补区域以免产生“发夹”结构,影响杂交。一个好的探针最终在实践中才能加以确认。另外,还有利用M13噬菌体载体可复制单链DNA的特点,复制合成DNA探针,利用转录载体(DNA),转录合成RNA探针。下面就GIBCoBRL公司(Bethesda Research Laboratories美国)的缺口平移法标记生物素试剂盒(bionick labeling system)为例介绍如下:

试剂 10x dNTP Mix.250μl 10x Enzyme Mix 250μl
0.2mmol/L each dCTP,dCTP,dTTP 0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ
0.1mmol/L dATP 0.0075 units/μl DNase Ⅰ
0.1mmol/L biotin-14-dATP 50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)
500mmol/L Tris-HCl(pH7.8) 5mmol/L magnesium acetate
50mmol/L MgCl2 1mmol/L β-mercaptoethanol
100mmol/L β-mercaptoethanol 0.1mmol/L phenylmethyl-
sulfonyl fluoride
100μg/ml nuclease-free BSA 50%(v/v)glycerol
100μg/ml nuclease-free BSA
Control DNA:5μg pBR322 in TE
stop buffer 300 mM EDTA
autoclaved H2O

操作步骤:

将5μl 10x dNTP Mix.;-μl DNA(相当1μg需标记的DNA量);-μl灭菌蒸馏水加至45μl;再加5μl10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml离心管后。15000xg离心15秒钟。16℃保温1小时。加5μl Stop Buffer终止反应。乙醇沉淀,备用。

32 核酸的分离与纯化 | 分子生物学实验诊断技术 32
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