蛋白质测序

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蛋白质测序


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概念

当前,所谓蛋白质测序,主要指的是蛋白质一级结构的测定。蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。多肽链的氨基酸顺序,它是蛋白质生物功能的基础。

蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来,现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。  

测序要求

●1 样品必需纯(>97%以上);

●2 知道蛋白质的分子量;

●3 知道蛋白质由几个亚基组成;

●4 测定蛋白质的氨基酸组成;并根据分子量计算每种氨基酸的个数。

●5 测定水解液中的氨量,计算酰胺的含量。  

蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定

●1链的拆开和分离

●2测定蛋白质分子中多肽链的数目

●3二硫键的断裂

●4测定每条多肽链的氨基酸组成,并计算出氨基酸成分的分子比

●5N端、C端的测定

●6多肽链断裂

●7测定每个肽段的氨基酸顺序。

●8确定肽段在多肽链中的次序。

●9确定原多肽链中二硫键的位置。  

酸水解

●常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解,反应时间约20小时。

●此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏;

●含有羟基的氨基酸如丝氨酸苏氨酸有一小部分被分解;门冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。  

碱水解

●一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。

●由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏,产率不高。部分的水解产物发生消旋化。

●该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。  

酶水解

●目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶(proteolytic enzyme)或称蛋白酶(proteinase)已有十多种。

●应用酶水解多肽不会破坏氨基酸,也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。  

测定步骤

1 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子,必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起,称为寡聚蛋白质,如,血红蛋白为四聚体,烯醇化酶二聚体;可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理,即可分开多肽链(亚基).

2 测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系,即可确定多肽链的数目。

3 二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起,可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下,用过量的-巯基乙醇处理,使二硫键还原为巯基,然后用烷基化试剂保护生成的巯基,以防止它重新被氧化。

二硫键的切割与保护(元素后数字为下标)

a 过甲酸〔performic acid〕 不可逆

-CH2SO3H

b、还原+氧化 不可逆

[ 巯基乙醇,DTT ] + 碘乙酸

-S-CH2-COOH

c、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

-R1-S-S-R2 + HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力;应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

巯基(-SH)的保护

保护巯基化学反应

作用:这些反应(见右图)可用于巯基的保护。

4 测定每条多肽链的氨基酸组成,并计算出氨基酸成分的分子比(如右图)

Bkadn.jpg

5 分析多肽链的N-末端和C-末端

多肽链端基氨基酸分为两类:N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽链氨基酸顺序分析中,最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法),C末端分析法(肼解法;酶降解法;硼氢化锂法)。

6 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片,并将其分离开来。

7 测定每个肽段的氨基酸顺序

8 确定肽段在多肽链中的次序。

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠,拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

9 确定原多肽链中二硫键的位置

一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链,再利用双向电泳技术分离出各个肽段,用过甲酸处理后,将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析,然后同其它方法分析的肽段进行比较,确定二硫键的位置。

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