双向电泳

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双向电泳(two-dimensional electrophoresis)

等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离),然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化. 双向电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿pH梯度分离,至各自的等电点;随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候,蛋白质组的分析变得可行.

样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效,目标是尽可能扩大其溶解度和解聚,以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白,两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP )取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键,增强了蛋白的溶解度,并导致转至第二向的增加]. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度,作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下,可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外,机械力被用来对蛋白分子解聚,如超声破碎]等. 另外,添加PMSF等蛋白酶抑制剂,可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的,可在其水化的过程中加样,覆盖整个IPG胶,避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失]. 此外,低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能,代表蛋白质组研究的“冰山之尖”,故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1~15 mg级的标准)、应用敏感性检测,可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生,对PI(等电点)超过10的碱性蛋白,通过产生0~10%的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲丙烯酰胺来增加基质的稳定性. 

2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性. 高分辨率确保蛋白最大程度的分离,高重复性允许进行凝胶间配比(match). 对2-DE而言,有3种方法分离蛋白:1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技术为基础. 第一向应用载体两性电解质(carrier ampholyte, CA),在管胶内建立pH梯度. 随着聚焦时间的延长,pH梯度不稳,易产生阴极漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦达到平衡状态,碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失. 因此,在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成,但很难控制. 3)IPG-DALT发展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题. IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度,克服了IEF的缺点,从而达到高度的重复性. 目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线,范围或宽或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3~5或碱性pH 6~11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4~7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomic contigs)从而有效分离.

分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外,还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前,没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术. 银染已成为一种检测2-DE的流行方法,可检测少到2~5ng的蛋白,因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色,一些有机染料不适于PVDF膜. 放射性标记不依赖其代谢的活性,并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳),即应用两种不同的染料荧光标记两个样品,使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个,避免了几种2-DE的比较,可在纳克级进行检测.

较早期相比,2-DE有两个主要的进步:首先,极高的重复性使有机体的参考图谱,可通过Internet获得,来比较不同组织类型、不同状态的基因表达;其次,高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.

常见问题及其解答重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽,直接跑 2D 的一向吗? 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完 1D 和 2D 胶后,会有很多横向条纹。所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面? 这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条,这个盖子上设计了对应的突起,以便压住胶条。由于虹吸作用,这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽,从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中,那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生,可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量( 80 %满)的矿物油。 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)? 电流的平方和功率成正比。电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子,从而对等电聚焦产生影响。 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高? 刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的 pH 区域移动。 跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动? 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂,当它移动到酸性区时( pH4 ),颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前。 跑第一向时,为什么电压总达不到预定值? 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。 跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低? 当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值,从而变成中性分子。这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越来越小。 跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生? 等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域,而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气。 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是什么? 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后,就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率,可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用,防止它们的聚集。 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值? 可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾? 横的脱尾可能是: 1 )一向等电聚焦不完全; 2 )某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3 )蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时,蛋白的溶解度不好。 什么成分会影响 2D 胶的效果? 核酸,盐,去垢剂等等。 2D 胶的上样量应该在什么范围? 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系,上样量大概在 100 微克(银染)到 500 微克(考染)之间。 我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩? 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法,沉淀法和透析法。超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附)。另外超滤对样品的要求比较高。甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果。沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失)。沉淀法中,又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次,去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品,量小时,操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境( 不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后再进行超滤。

附:双向电泳完整的操作步骤

(一)第一向等电聚焦

1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶解。

2. 在小管中加入0.01g DTT, Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混匀。

3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品,充分混匀。

4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4-7),室温中放置10分钟。

5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

7. 分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。

8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

9. 对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。

10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。

(二)第二向SDS-PAGE电泳

1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液,每块凝胶40ml,将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用MilliQ水(没有milliq的话ddh2o也行,注,水云深浪按)、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合。

2. 待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。

3. 从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解。

4. 配制胶条平衡缓冲液I。

5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

6. 将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

7. 配制胶条平衡缓冲液II。

8. 第一次衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。

10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

11.将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

12.第二次衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

13.将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

15.用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。

16.放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

18.在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

19.电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。

20.进行染色。

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