脉冲场凝胶电泳

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(PFGE,Pulsed Field Gel Electrophoresis)是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中,大的DNA分子(>10kb)移动速度接近,很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中,电场不断在两种方向(有一定夹角,而不是相反的两个方向)变动。DNA分子带有负电荷,会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向,而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。  

目录

高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工

1.收集10ml全血,加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。

2.2000r/min离心10min,移去红色上清液,再次用细胞裂解液洗涤细胞,然后用PBS重悬细胞。

3.稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。

4.用PBS重悬细胞,以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例(1百万个倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg)

5.用PBS配制2%浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。

6.将等体积(各1ml)细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀,立即倒入凝胶块模具中。

7.静置20min让琼脂糖固化,用无菌塑料杯(通常用作划菌)将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中,加入2mg/ml的蛋白酶K。

8.将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2~3天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。

9.蛋白酶K消化后,可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10. 此外,继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。

11. 将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中,灭活残留的蛋白酶K。

12. 室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管,可直接用于酶切反应或用0.5mol/L

EDTA,(pH8.0)4℃保存凝胶块。

13. 若用EDTA保存凝胶块,取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。  

大小标准物的制备

λ多联体

1.以TE缓冲液悬浮λ多联体(Boehringer MA宝灵曼公司产品),浓度为4μg/40μl。

2.用等体积TE配制的2%低熔点琼脂糖(温度保持在45℃)混匀。

3.移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。

4.室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。  

酵母染色体

1.从YPD(酵母提取物,蛋白胨葡萄糖培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml

YPD预培养的肉汤中,30℃下剧烈震荡生长24小时,然后加入200ml YPD肉汤,剧烈振荡24~48h(产量大约100块)。

2.4000×g转速,离心10min,然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液悬浮。

3.仍以4000×g转速离心10min,再用SCE[1 mol/L 山梨醇,0.1mol/L枸椽酸钠,pH5.8及10 mmol/L

EDTA (pH7.5)]溶液重悬。

4.取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。

5.溶液短暂离心后,再用SCE重悬细胞,使40μl SCE溶液中含5×107个细胞(相当于80μl体积的模块中含有5×107个细胞)。

6.溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巯基乙醇混匀,37℃保温15~30min。

7.细胞悬液与等体积的SCE配制的2%低熔点琼脂糖凝胶混匀,保持在50℃。

8.将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。

9.凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37℃下振荡温育1~2小时。

10. 将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中,加入2mg/ml蛋白酶K,50℃温育48h。

11. 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗涤凝胶块3次,每次min。

12. 凝胶块可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。  

琼脂糖凝胶块中DNA的限制性内切酶消化

1.应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA降解。

2.在Falcon试管中用1×TE溶液漂洗凝胶块20min 3次,以去除EDTA。

3.混合:酶反应缓冲液(高、中或低盐缓冲液),100

mmol/L亚精胺(只用于高盐缓冲液状态),10~20单位的内切酶。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10μg DNA。

4.设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照,以检查是否有非特异性DNA降解。

5.将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中:通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。

6.若两种内切酶所需缓冲液条件一致,可以同时或先后用两种不同的酶进行消化(先用低盐缓冲液的酶消化,再调整盐浓度)。倘若首次消化的酶要求50℃条件,在第二个酶消化时要换缓冲液。

7.若要进行部分消化,则首先在同一温度和反应时间用1:10稀释的酶进行尝试。  

凝胶电泳

1.将0.8%的琼脂糖在0.25×TBE中熔化后冷却至50~60℃,立即注入凝胶框架中,并插入梳子。

2.凝胶固化后小心地拔出齿梳,用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块,则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。

3.用1%液态低熔点琼脂糖凝胶(0.25×TBE配制)密封狭槽。

4.若有气泡存在,用注射器驱赶气泡。

5.一旦密封的低熔点琼脂糖已固化(大约10min),可将凝胶搁入腔室,并用电泳缓冲液覆盖过胶面。

6.应设定合适的电压及转换时间(参考《分子医学技术》84页表8.1)并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。

7.电泳结束后,凝胶用0.25×TBE配制成的EB(0.4μg/ml)染色

8.用泵自槽中排除缓冲液,续以双蒸水冲洗电泳槽。

9.凝胶成像:DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。

10. 用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min,让DNA脱嘌呤,并有利于转移。

11. 凝胶用碱(变性溶液中)变性20min,两次,续以中性溶液1~5min。

12. 采用标准Southern印迹方案将DNA转印至尼龙膜上。一般来说,印迹PFGE凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长(约48h)。

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