毛细管电泳法

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毛细管电泳】是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。

【所用设备】主要部件有0~30kV可调稳压稳流电源,内径小于100μm(常用50~75μm)、长度一般为30~100cm的弹性石英毛细管、电极槽、检测器和进样装置。检测器有紫外/可见分光检测器、激光诱导荧光检测器和电化学检测器,前者最为常用。进样方法有电动法(电迁移)、压力法(正压力、负压力)和虹吸法。成套仪器还配有自动冲洗、自动进样、温度控制、数据采集和处理等部件。

毛细管电泳所用的石英毛细管柱,在pH值>3的情况下,其内表面带负电,与缓冲液接触时形成双电层,在高压电场作用下,形成双电层一侧的缓冲液由于带正电而向负极方向移动,从而形成电渗流。同时,在缓冲溶液中,带电粒子在电场作用下,以各自不同速度向其所带电荷极性相反方向移动,形成电泳。带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和。各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离。

目前,毛细管电泳的分离模式有以下几种。

(1)毛细管区带电泳,用以分析带电溶质。为了降低电渗流和吸附现象,可将毛细管内壁涂层

(2)毛细管凝胶电泳,在毛细管中装入单体,引发聚合形成凝胶,主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物。另有将聚合物溶液等具有筛分作用的物质,如葡聚糖聚环氧乙烷,装人毛细管中进行分析,称毛细管无胶筛分电泳,故有时将此种模式总称为毛细管筛分电泳,下分为凝胶和无胶筛分两类。

(3)胶束电动毛细管色谱,在缓冲液中加入离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠,形成胶束,被分离物质在水相和胶束相(准固定相)之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移,达到分离。本模式能用于中性物质的分离。

(4)亲和毛细管电泳,在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基,以亲和力的不同达到分离目的。

(5)毛细管电色谱,是将HPLC的固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂布固定相,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程,此模式兼具电泳和液相色谱的分离机制。

(6)毛细管等电聚焦电泳,是通过内壁涂层使电渗流减到最小,再将样品和两性电解质混合进样,两个电极槽中分别为酸和碱,加高电压后,在毛细管内建立了pH梯度,溶质在毛细管中迁移至各自的等电点,形成明显区带,聚焦后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器。

(7)毛细管等速电泳,采用先导电解质和后继电解质,使溶质按其电泳倘度不同得以分离。

以上各模式以(1)、(2)、(3)种应用较多。

电极槽和毛细管内的溶液为缓冲液,可以加入有机溶剂作为改性剂,以及加入表面活性剂,称作运行缓冲液。运行缓冲液使用前应脱气。电泳谱中各成分的出峰时间称迁移时间。胶束电动毛细管色谱中的胶束相当于液相色谱的固定相,但它在毛细管内随电渗流迁移,故容量因子为无穷大的成分最终也随胶束流出。其他各种参数都与液相色谱所用的相同。

一、对仪器的一般要求

所用的仪器为毛细管电泳仪。正文中凡采用毛细管电泳法测定的品种,其所规定的测定参数,除分析模式、检测方法(如紫外光吸收或荧光检测器的波长、电化学检测器的印加电位等)应按照该品种项下的规定外,其他参数如毛细管内径、长度、缓冲液的pH值、浓度、改性剂添加量、运行电压或电流的大小、运行的时间长短、毛细管的温度等,均可参考该品种项下规定的数据,根据所用仪器的条件和预试验的结果,进行必要的调整。

二、系统适用性试验

高效液相色谱法项下,按各品种项下的要求,进行预试验,并调节各运行参数使达到规定指标,方可正式测定。

三、测定法

同高效液相色谱法项下。目前毛细管电泳仪的进样精度较高效液相色谱法低,定量分析时以用内标法为宜。

毛细管电泳在蛋白质分离分析中的应用研究进展

20世纪90年代初,Manz和Widmer等¨3首次提出了以微机电加工技术(microelectromechanicalsystems,MEMS)和分析化学为基础的微全分析系统(miniaturized total analysis systems,斗TAS)的概念。1992年,Manz等口。首次报道了基于微流控

芯片的高效高速毛细管电泳(CE)分离系统。近年来该技术发展迅速,在蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)等生物大分子的分离分析中表现出了显著的优越性。当前,随着蛋白质组研究的深入和发展,如何实现蛋白质快速高效的分离成为需要解决的重要问题。在芯片上进行蛋白质的毛细管电泳分离可以显著地提高分析速度和分离效率,因此,这一研究方向引起了广泛关注,已有较多论文发表。本文对采用微流控芯片毛细管电泳进行蛋白质分离的分离模式、特点及其蛋白质吸附问题进行了介绍。

1 微流控芯片毛细管电泳的特点

芯片毛细管电泳技术将常规的毛细管电泳操作在芯片上进行,利用玻璃、石英或各种聚合物材料加工微米级通道,以高压直流电场为驱动力,对样品进行进样、分离及检测。它与常规毛细管电泳的分离原理相同,因此在分离生物大分子样品方面具有优势。此外,与常规毛细管电泳系统相比,芯片毛细管电泳系统还具备分离时间短、分离效率高、系统体积

小且易实现不同操作单元的集成等优点"“1。芯片毛细管电泳的上述优点使其成为蛋白质分离分析中的重要手段之一。

Rodriguez等一。曾分别在常规毛细管、短毛细管和玻璃芯片上,以区带电泳的分离模式,对人免疫球蛋白G(IgG)和荧光素异硫氰酸酯(FITC)的反应混合物进行分离,以比较3种系统的分离性能。使用有效分离长度为35 am的长毛细管和有效分离长度为6 am的短毛细管时,其分离时间分别为335 S和84 S,理论塔板数分别为27 750和41 816。当使用有效分离长度仅为2.8 cm的玻璃芯片时,分离时间缩短至15 S,理论塔板数达到49 000。由此可以看出采用玻璃芯片进行毛细管区带电泳在分离速度和柱效上明显优于常规毛细管电泳系统。

2 微流控芯片毛细管电泳分离蛋白质的模式

目前,文献报道的芯片毛细管电泳分离蛋白质主要采用区带电泳、凝胶电泳、等电聚焦、胶束电动色谱及二维电泳等模式。

2.1 芯片毛细管区带电泳

毛细管区带电泳是芯片毛细管电泳分离蛋白质的一种最基本的分离模式。它基于不同的蛋白质分子在电场中的迁移速率不同而实现分离,是一种简单、快速的分离方法。采用区带电泳分离模式已成功地分离了多种蛋白质样品。

Colyer等¨1采用毛细管电泳芯片,以区带电泳模式对人血清蛋白样品进行了分离,可分辨出4个蛋白质区带(即IgG、转铁蛋白、a-1-抗胰蛋白酶白蛋白区带,分别用以模拟血清蛋白样品中的7、p、dl和白蛋白区带)。其中蛋白质的荧光标记在分离之后进行,由于荧光染料TNS(2-toluidinonaphtha.1ene-5一sulfonate)标记血清蛋白的灵敏度较低,所

以没能实现实际人血清蛋白样品的5个区带分离。Xiao等H。采用区带电泳模式,以50 mmoVL磷酸盐缓冲液(pH 2.15)作为工作缓冲液,在通道宽度为30斗m的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片中,于35内实现了细胞色素C溶菌酶的快速分离。Dodge等。1 0。设计了集成8个阀和1个泵的PDMS芯片,通过微阀微泵实现了对液流的有效控制。他们首先采用区带电泳的分离模式分离牛血清白蛋白和肌红蛋白,然后通过阀的作用将分离后的蛋白质组分分别引入微混合器中酶解,最后对产物进行质谱分析。该工作显示芯片技术可用于质谱分

析前复杂蛋白样品的预处理。庄贵生等¨¨在石英芯片上以75 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 10.3)作为芯片电泳缓冲体系,分离了免疫球蛋白、O/一1一抗胰蛋白酶、牛血清白蛋白和铁传递蛋白,并对经临床确诊的妊娠高血压症、风湿性心脏病多发性骨髓瘤患者

的尿液样品进行电泳分析,在2 min内得到了与美国Helena电泳系统一致的分析结果。

在芯片毛细管电泳分离蛋白质的研究中所要解决的一个重要问题就是通道表面对大分子蛋白质的吸附问题。蛋白质与芯片通道内壁之问的微小吸附效应就会降低蛋白质的分离效率,引起峰形变宽拖尾,影响分离的重现性。在毛细管区带电泳分离模式下,一般采用通道内壁永久改性和缓冲液中加入添加剂进行动态修饰两种方法来抑制蛋白质的

吸附。

Wu等。1驯采用多层88%水解聚丙烯醇(PVA)修饰PDMS芯片,以区带电泳模式有效分离了两种碱性蛋白质(溶菌酶和核糖核酸酶)以及两种典型的酸性蛋白质(牛血清白蛋白和口.乳球蛋白)。该涂层在pH 3~11范围内均可抑制电渗流的产生和蛋白的吸附作用,并且效果稳定,连续运行70次后分离效果仍然很好。该研究组‘1}”1随后又采用自组装方法在PDMS芯片通道表面加工环氧修饰的聚合物涂层抑制蛋白质的吸附,成功地分离了溶菌

酶和核糖核酸酶A

Chiem等¨5。在运行缓冲液中加入了无机电解质NaCl和中性表面活性剂吐温20来抑制蛋白质的吸附,利用芯片毛细管区带电泳进行了单克隆抗体的分离分析。 ‘

2.2芯片毛细管凝胶电泳

在蛋白质组学和蛋白质分离研究中,凝胶电泳是广泛使用的分离技术。它是以凝胶等聚合物作为分离介质,利用其网络结构并依据被测组分的分子体积不同而进行分离的一种分离模式。在芯片上采用凝胶电泳模式分离蛋白质,更有利于实现分离操作的高速度和高效率。Yao等¨6。采用十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶电泳分离模式,对比了芯片SDS毛细管凝胶电泳与常规毛细管凝胶电泳系统分离蛋白质的性能,结果表明前者的分离效率明显优于后者,

分离时间也明显低于后者。

与常规毛细管凝胶电泳相同,芯片毛细管凝胶电泳常用的筛分介质也分为凝胶和非胶聚合物溶液两种。交联聚丙烯酰胺凝胶是广泛使用的一种凝胶筛分介质,Herr等…1首次将传统的SDS.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS.PAGE)分离蛋白质的方法移植到芯片上,采用光聚合的方法在芯片通道内制备浓度为6%的交联聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质,在30S的时间内对相对分子质量(M,)在5 500~39 000之问的5种蛋白质进行分离,分离距离仅为4 mm,

分离效率达到理论塔板数4.41×105。该研究组’1引后期又在微通道内制备了浓度为22%的交联聚丙烯酰胺膜用于蛋白质样品的预富集,有效富集了相对分子质量为12 000~205 000的蛋白质分子,并采用浓度为8%的交联聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质

进行分离。

Agirregabiria等¨引在聚甲基丙烯酸甲酯(PM—MA)芯片上使用SU一8光胶制作微通道,采用浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质分离蛋白质。随后该研究组’2叫又在该芯片上集成金属电极,采用相同的分离模式成功地分离了相对分子质量分别为20 000和97 000的胰蛋白酶抑制剂磷酸化酶两种蛋白质.

然而,交联聚阿烯酰胺凝胶存在制备复杂、不易使用等问题。‘-i其相比,线性聚丙烯酰胺(PLA)、聚乙烯醇(PEG)、聚氧化乙烯(PEO)等非胶筛分介质具有制备简单、使用方便、可以先聚合后注入通道而无需在通道内进行聚合反应等优点,适合在复杂的通道体系中使用,因此在芯片毛细管凝胶电泳中非胶筛分介质得到了广泛的应用。Yao等Ⅲ一采用SDS 14.200凝胶缓冲液(Beckman Coulter公司产品)在玻璃芯片上于35 s内分离了相对分子质量在9 000~l 16 000之间的6种蛋白质。Giordano等“1将NanoOrange染料加入样品和缓冲液中进行蛋白质的动态标记,并对分离缓冲液体系进行了优化,最终选择5%的PEO(M,=100 000)作为筛分介质。该系统对牛血清白蛋白的检出限为500ng/mL,并完成了对实际人血清样品的分离分析。

在芯片毛细管凝胶电泳中,通道内壁对蛋白质的吸附仍是需要解决的重要问题。Bousse等z:一使用聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)物理涂覆玻璃芯片微通道内壁,将电渗流降低到0.5×10~m zV s .以SDS凝胶电泳的分离模式在40 s内分离了Bio—Rad公司的蛋白质标准样品’,分离效率达到107塔板/m。Nagata等。2 3]在PMMA芯片中使用了PEG涂层,以5%线性聚丙烯酰胺为筛分介质,在分离长度为3 mm的通道内实现了胰蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白和卢。半乳糖苷酶3种蛋白质的高速分离,分离时间仅为8 S,

2.3 芯片等电聚焦分离

芯片等电聚焦分离蛋白质的原理与常规毛细管等电聚焦基本相同,都是依据蛋白质的等电点(p,)不同而进行分离。Hofmann等。241首次将毛细管等,应用于蛋白质分析

Li等”。在PDMS芯片和聚碳酸酯(PC)芯片上,采用等电聚焦模式分离厂牛血清白蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。Das等。26 3采用高聚物芯片,在等电聚焦电泳模式下优化了,分离长度及电压条件,最终在长1.9 cm的通道内于1.5 min内分离了绿荧光蛋白和R藻红蛋白,分离电压为500 V。Cui等“’在PDMS芯片上采用等电聚焦分离模式成功分离了组绿荧光蛋白、异藻青蛋白和藻红蛋白。该作者还报道,通过改变样品和分离介质中添加剂

甲基纤维素的浓度,可以改变完成蛋白质分离所需要的通道距离,

Tsai等、”J通过采用六甲基二硅氧烷等离子聚合膜修饰玻璃芯片通道的方法抑制蛋白质吸附,在等电聚焦的分离模式下分离了藻青蛋白(p,:4.65)、血红蛋白(p,=7.0)和细胞色素C(p,:9.6)3种蛋白质混合物,分离在3 min内完成,分离效率为19 600塔板/m。Huang等。291在进行芯片等电聚焦分离蛋白质时,采用在两性电解质溶液中加入羟甲基纤维素作为添加剂的方法来抑制蛋白质的吸附、

2.4芯片胶束电动毛细管电泳

胶束电动毛细管电泳是毛细管电泳与胶束增溶色谱相结合的分离技术,其原理是在装有胶束溶液的通道内,溶质组分在电场力的作用下根据其在胶束相和水相之问的分配不同而产生分离。Jin等一,一在玻璃芯片上采用胶束电动色谱的分离模式,以Bio—Rad公司的CE.SDS缓冲液作为分离介质,成功实现了相对分子质量在14 400~200 000之间的8种蛋白质的分离。Dou等二一采用Brij35(polyoxyethylene[23]dodecan01)修饰PDMS芯片通道,在胶束电动色谱的分离模式下实现了葡萄糖氧化酶和肌红蛋白的有效分离。该芯片涂层在

pH 2~6范围内可显著降低蛋白质大分子的吸附,并减少检测蛋白质所需的冲洗时问,从而提高分离效率。Huang等。”。在PDMS芯片中采用0.1%十二烷基麦芽糖(DDM)和0.03%SDS作为混合胶束,对通道进行动态修饰,有效地抑制了蛋白质的吸附,控制了电渗流,使蛋白质在非变性条件下得到有效分离.

2.5芯片二维电泳分离

芯片毛细管电泳应用的成功促进了高速高效的芯片二维电泳技术的发展。对于多组分的复杂蛋白质样品,采用传统的一维分离方法通常无法满足要求,需要采用二维分离技术来提高分离效率,增加峰容量。与传统的毛细管电泳系统相比,在芯片上进行二维电泳分离,可以通过设计芯片通道结构实现通道的直接交叉或连通,而无需制作复杂的二维毛细管电泳接口,从而避免了因在接口处存在死体积而导致的谱带扩展现象。

在芯片二维电泳分离蛋白质的研究中,第一维分离模式多采用等电聚焦模式。Chen等∞1制作了二维毛细管电泳PDMS芯片,利用第一维的等电聚焦和第二维的凝胶电泳对荧光标记的牛血清白蛋白和碳酸酐酶以及德科萨斯红标记的卵清蛋白进行分离分析。Li等”4j设计了等电聚焦和凝胶电泳联用的二维分离高聚物心4t-片。蛋白质样品在完成第一维的等电聚焦分离后,可在多个并行的通道内完成第二维的凝胶电泳分离。整个分离过程在10 min内完成,峰容量达到1 700。Herr等:”1研制r采用十字通道构型的等电聚焦一自由区带电泳二维芯片系统,芯片通道宽200斗m,深20斗m,待测样品在横向通道中进行等电聚焦分离,分离后的样品区带在电场驱动下进入纵向区带电泳通道中进行第二维分离。系统采用荧光显微镜成像的方法对分离性能进行了评价,5 min内分离的峰容量达到1 300。Wang

等”。通过在PDMS芯片中制作微阀来防止一维等电聚焦和二维凝胶电泳系统之间的分离缓冲液相混合,在20 rain内有效分离了4种标准蛋白质。也有报道在PMMA芯片上进行SDS凝胶电泳和胶束电动毛细管电泳相结合的蛋白质二维电泳分离。”1。该系统在12 min内完成10种蛋白质的分离,峰容量约为l 000。

此外,还有一类基于芯片的二维分离系统主要应用于蛋白质酶解物的分离分析。通常第一维分离采用胶束电动毛细管电泳或毛细管电色谱模式,第二维分离采用区带电泳模式2000年,Ramsey课题组。“1首次在玻璃芯片上建立了胶束电动毛细管电泳(第一维)与区带电泳(第二维)结合的二维分离系统,并应用于细胞色素C、核糖核酸酶、d哥L白蛋白等的胰蛋白酶降解产物分离。其后,该课题组对系统进行了改进,加长了第一维电泳通道的长度,并采用细径转角通道来降低扩散,在约15 min内分离了牛血清白蛋白酶解物,峰容量达到4 200【3…。2001年,他们还研制了开管电色谱和区带电泳相结合的芯片二维电泳系统,其电色谱分离部分采用长25 cm的具有十八烷基三甲氧基硅烷涂层的环状通道,区带电泳部分则采用长1.2 am的直形通道,在13 min内实现了届一酪蛋白胰蛋白酶解产物的分

离。401。

相对于一维分离芯片,二维芯片分离系统具有很高的分离效率和峰容量,预计会在复杂蛋白质样品的分离上发挥更大的作用。

2.6芯片自由流电泳

除上述分离模式外,芯片自由流电泳也是芯片电泳分离蛋白质的重要方法。芯片自由流电泳是指在芯片中通过外加电场使样品随缓冲液连续流动的同时沿电场方向进行电迁移,从而按照电泳淌度不同实现分离的电泳分离模式。Raymond等¨¨采用芯片自由流电泳模式分离了人血清蛋白、缓激肽和核糖核酸酶A,其分离长度为3.1 cm,流出时间为62 S。Kobayashi等。4 2。采用自由流电泳的分离模式在一个体积为56.5 mm×35 mm×30仙m的微分

离室(60斗L)中实现了持续的蛋白质分离,并用羟丙基甲基纤维素涂覆来抑制蛋白质吸附,在25 min内有效分离了细胞色素C和肌红蛋白。最近,Kohl.heyer等H 3。制作了一种自由流等电聚焦分离蛋白质的玻璃芯片,成功地将人血清白蛋白(pI=4.4)与等电聚焦标记物(pH 3和9)分离。

3 展望

微流控芯片毛细管电泳系统应用于蛋白质的分离分析具有突出的优越性,特别是在临床检验及现场监测等方面的应用具有良好的发展前景,同时,其对分析仪器的集成化、微型化与便携化的发展也具有重要意义。据文献报道,Renzi等‘441已经研制出手持式的微流控芯片电泳分离蛋白质装置。该装置由电泳芯片、小型激光诱导荧光检测系统以及高压电源等组成,其体积仅为11.5 cm×11.5 cm×19.0 cm,可用于现场分析、床旁医学诊断以及取证分析。近年来,国内已有关于利用芯片毛细管电泳进行临床尿蛋白…’4 5。和脂蛋白。46。检测的报道。最近,Pandey等”川使用Caliper公司和Agilent公司的P200蛋白质芯片来检测微量的白蛋白尿,将蛋白质的电泳分离和荧光检测集成化、自动化,实现了其在临床实验室的应用。

目前,很多科研工作者正致力于微流控芯片毛细管电泳与质谱联用技术的研究,以进一步提高系统对复杂样品的分离分析能力。上述系统在蛋白质分离分析及蛋白质组研究中有广阔的应用前景。尤其是对于复杂蛋白质样品的多维分离分析,芯片毛细管电泳以其快速高效的特点,可以作为其中的一维分离方法,显著提高蛋白质的分析通量。相信随着研究的不断深入及相关技术的不断发展,微流控芯片毛细管电泳蛋白质分离技术将日趋成熟,在生

化分析、临床诊断和蛋白质组研究领域发挥重要的作用

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