医学遗传学/限制性片段长度多态性

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医学遗传学基础

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一个人的两套单倍体DNA是不完全相同的,一般每100-500个碱基对就有一个是不相同的。换言之,如果把两套基因组DNA(各3.2×109bp)排列起来,那么平均有1000万处不同,它们多位于内含子序列中。实际上,除单卵双生子外,人群中没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。

DNA的多态性虽可通过DNA测序检出,但用限制酶消化却是最常用的检测方法。

1.RFLP由于碱基变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现,从而引起不同个体在用同一限制酶切时,DNA片段长度出现差异(图13-3),这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异,称为限制性片段长度多态性(restriction fragmentlength polymporphism, RFLP)。RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异,它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法(见下节)检出。用Southern杂交检出RFLP时,如探针跨越切点,则被切开的两个片段均可与探针杂交,从而显示两条杂交带(图13-4)。

RFLP示意图箭头酶切位点


图13-3 RFLP示意图箭头酶切位点;

左图:等位基因2由于出现新的切点,DNA片段缩至8kb;

右图:DNA片段电泳后杂交图

RFLP的检出等位基因


13-4 RFLP的检出等位基因1因有额外切点而导致产生

两个长短不同的DNA片段(3kb及5kb)且均能与探针杂交

2.两点RFLP

(1)点态(point polymorphism):是由于单个或少数碱基的改变引起酶切点的出现或消失所致的RFLP。上述的RFLP即属于这一类。它们属经典的RFLP。在人类基因组中已发现数以百计的此类多态位点

(2)数目变异的串连重复(variable number tandem repeats,VNTR):上述经典的单个碱基取代所致的RFLP一般只能检测到一种杂合性的两种形式,即“有”或“无”某个限制酶切位点,而且每个位点在人群中的杂合子频率通常不会超过50%,当被测个体为纯合状态时,利用RFLP就无法得到所需要的多态信息。此外,在整个基因组中,这类RFLP目前发现的数量还有限,并分布不匀。

但是,在人类基因组中还存在一类DNA重复序列,称为小卫星DNA。它们分布十分广泛,每一个单位通常只有16-28bp长,但其重复次数在人群中是高度变异的。当用限制酶切割VNTR区时,只要酶切点不在重复区内,就可能得到各种长度不同的片段(图13-5)

与小卫星DNA不同,另一类重复序列是卫星DNA。它们的基本序列有1-6bp,如(TA)n、(CGG)n等,通常重复10-60次并呈高度的多态性。

VNTR导致的RFLP重复次数的变异致酶切位点的移动和DNA片段长度的变异


图13-5 VNTR导致的RFLP重复次数的变异致酶切位点的移动和DNA片段长度的变异

VNTR具有高度的变异性,同时也是按照孟德尔方式遗传的,因此是很好的遗传标记,由于它们类型众多和在基因组中分布广泛,因而在基因连锁诊断中应用日益广泛。

32 限制性核酸内切酶 | 常用基因诊断技术 32
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