医学遗传学/遗传病的基因诊断举例

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医学遗传学基础

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1.基因缺失型遗传的诊断

(1)α地贫的基因诊断:α地贫主要是由于基因缺失引起的,缺失的基因可以由1-4个。正常基因组用BamHⅠ切割,可以得到一个kb的片段,而缺失一个α基因时切点向5’端移位,得到一条10kb的片段。因此,当用α基因探针与基因组DNA进行Southern杂交时(图13-8),在α地贫2可见一条14kb和一条10kb的带,在正常人可见一条双份的14kb的带,而在α地贫1则见一条单拷贝的14kb带,血红蛋白H病时只有一条10kb的带的,而在Barts水肿胎时,则无任何杂交带。

α地贫基因缺失的诊断


图13-8 α地贫基因缺失的诊断

左图:16号染色体上携有数目不同的基因

右图:α基因探针杂交的结果

箭头:BamHⅠ切点

一种较简便的方法是直接用α探针进行斑点杂交,自显影后根据斑点深浅的不同也可以对α地贫作出诊断。更为简单的方法是PCR诊断,即在α基因缺失范围内设计一对引物,然后PCR扩增胎儿的DNA,如为Barts 水肿胎,则无扩增产物,电泳后无任何带纹,从而可建议进行人工流产,但此法不能诊断其它类型的地贫(除非另设计引物用作PCR)。

(2)DMD/BMD的缺失型诊断:DMD/BMD是一种Ⅹ连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病(参阅第四章)。DMD/BMD有70%左右为缺失型。此基因很大,缺失可发生在不同部位,因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增(多重PCR)来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失,即可作出诊断并对缺失定位(图13-9),在进行产前诊断时,一般可先通过检测家系中有关成员,即确定先证者的缺失区,然后有针对性地作PCR扩增,包括缺失部分的两端,以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失,但非缺失型不能用此法查出。

2.点突变型遗传病的基因诊断2

(1)镰形细胞贫血的基因诊断:已知突变基因是编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG,从而使缬氨酸取代了甘氨酸,因此可用如下方法进行诊断。

DMD基因缺失的多重PCR诊断


图13-9 DMD基因缺失的多重PCR诊断

exon:外显子;pm:启动子;1:正常9条带;2:基因全缺失;3:启动子区缺失;4:第3外显了缺失;5:第13外显子缺失;6:第47外显子缺失;7:47-52外显子区段缺失;8:第52外显子缺失

1)RFLP诊断:已知限制酶MstⅡ切割的识别顺序是CCTNAGG,它能切割正常β链中CCTGAGG序列,但不能切割突变了的CCTGTGG(A→T)。这样,由于突变消除了一个切点,使内切酶长度片段发生了改变,通过电泳,就可以区别正常的βA和βS(图13-10)。

镰状贫血的基因诊断


图13-10 镰状贫血的基因诊断

除MstⅡ外,限制酶DdeⅠ(识别序列为CTNAG)也能够把正常的βA基因与镰变了的βS基因区别开来,并用于诊断。

2)ASO探针诊断:由于突变部位和性质已完全明了,也可以合成寡核苷酸探针,用32P标化来进行诊断。此时需要合成两种探针,一种与正常βA基因序列完全一致,能与之稳定地杂交;另一种与突变基因序列一致,能与βS基因稳定杂交,但不能与正常的βA基因杂交。根据杂交结果,就可以把发生了突变的βS基因检测出来。

PCR技术问世以来,ASO诊断又有新的改进,即先PCR扩增长约110bp的基因片段,然后再与ASO探针杂交。这样可减少目的基因DNA用量,并降低与基因组DNA杂交时的非特异性信号。

3.基因异常不明的遗传病的诊断

成年型多囊肾病(adult polycystic kidney disease,APKD)是一种常染色体显性遗传病,发病率高,约1000人中有1名致病基因的携带者,起病较晚,多在30岁以后,主要为肾和肝中出现多发性囊肿临床表现腰疼蛋白尿血尿高血压肾盂肾炎肾结石等,最终可导致肾功能衰竭尿毒症。本病基因定位在16p13,与α珠蛋白基因3’端相邻,但致病基因尚未克隆,基因产物生化性质和疾病发病机理也尚未阐明。因此,目前只能用连锁分析来进行基因的发病前诊断和产前诊断。由于通过家系分析,已证实APKD的致病基因与α珠蛋白基因3’端附近的一段小卫星DNA序列即3’HVR(3’ hypervariable region)紧密连锁,而后者在人群中具有高度多态性,因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断(图13-11)。

成年型多囊肾病的连锁分析诊断


图13-11 成年型多囊肾病的连锁分析诊断

从图13-11可见,当用3’HVR作为探针与PvuⅡ酶切后的家系有关成员基因组DNA杂交时,可见有5.7、3.4和2.4kb的3种等位片段。患者的母亲有5.7和3.4kb两种片段,父亲为2.4kb纯合子,其子女凡有3.4片段者为患者,而凡无此片段者都不是患者。因此可知致病基因伴随3.4kb等位片段分离,即与之相连锁。图中Ⅱ5的DNA检查只有5.7和2.4kb而无3.4kb片段,故不是患者或致病基因携带者。

32 基因异常与诊断方法的选用 | 基因治疗 32
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