医学免疫学/分子生物学技术在免疫学诊断中的应用

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一、BCR和TCR基因重排检测

血细胞恶性变如白血病淋巴瘤等的诊断,长期以来多应用细胞形态学检查和免疫细胞表型分析。由于这些方法在特异性和敏感性上的限制,对于丢失了细胞表面标志,或分化较好难以和正常细胞区别。也可能由于恶性细胞数量少,混在大量正常细胞中难以查出。近年来由于分子生物学技术的广泛应用,且由于获得了Ig片段的特异基因克隆及TCR各链的基因克隆,在此基础上发展了应用Ig基因重排作为B细胞的特异标记,诊断B细胞来源的白血病的和应用TCR基因重排为T细胞特异标志诊断T细胞恶性变引起的白血病,从而将白血病的细胞学分类法提高到基因水平分析,建立了免疫基因型诊断的新方法,大大提高了诊断的敏感性和特异性。该方法不但可以确定细胞来源、分化程度,且由于DNA分析的高度敏感性而能查出显微镜不能看到的微小变化,从而能监测治疗效果,发现微量残留病变细胞。

该方法首先要从待检的细胞中分离出总DNA。在非T、非B细胞的Ig和TCR基因不发生重排称为胚基因(germ line)。而T和B细胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排,重排后的Ig和TCR片段,转移至硝酸纤维膜尼龙膜上,然后用同位素酶标记的Ig血病细胞进行分类鉴定,若有Ig基因重排说明恶性细胞来源于B细胞,若有TCR基因发生重排,则为T细胞来源的。如果既无Ig基因重排,又无TCR基因重排的淋巴细胞则属非T、非B细胞来源的瘤细胞。

二、限制酶切片段长度多态性组织配型

迄今,一直是血清学和细胞学方法进行HLA抗原结构分析,最近已开始应用分子生物学基因克隆技术进行HLA定型。由于人们已常握了HLA共同和特异的抗原的核苷酸序列,才有可能用此新方法进行组织配型检验。

限制酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)组织配型技术的原理是目前已掌握了编码HLA抗原的核苷酸序列,包括各等位基因共有的和专有的序列。HLA-A、-B、-C位点的Ⅰ类重链基因的核苷酸序列有高度同源性,由这些基因片段克隆可得HLAⅠ类专用的探针,因为检测HLAⅠ类抗原序列的标志,目前也已得到Ⅱ类抗原特异的探针。由于HLA等位基因的多态性是表现在其核苷酸序列的差异上,由这些基因中克隆出的特异DNA片段,就可检测这些基因的差别。由于核苷酸序列不同,被限制性内切酶作用部位(切点)也不同,这种酶切点只有4~6个核苷酸长度。因此来源于不同HLA单倍型的DNA可被一种内切酶切成不同长度的片段。在实际工作中,从细胞中提取基因组DNA(genomic DNA)的多态性比实际HLA-Ⅱ类抗原的多态性还要复杂,因为基因的内含子(不转录基因)序列不同,和外显子转录并翻译成蛋白质)序列差别均在酶切后的细胞总DNA中。

RFLP组织配型检测主要包括4个步聚(印迹):①提取细胞总DNA,用限制性内切酶消化;②凝胶电泳;③将凝胶中分离好的DNA片段转移至尼龙膜上;④经变性处理后用同位素标记的探针进行分子杂交。经放射自显影,得到显影带(bands)。即可得知分子量大小不同的DNA片段(图20-9)。

用RFLP进行组织定型比较三个标本的组织定型


图20-9用RFLP进行组织定型比较三个标本的组织定型

RFLP组织配型实验是用于血清学或细胞学检测失败的样品,如HLA抗原不表达(裸细胞)细胞脆性大而破碎,淋巴细胞减少没有足够的样品时。由于分子生物学方法采样少、特异、敏感的优点可弥补常规方法的不足。此外,RFLP组织配型法还可查出DNA变异基因重组的情况,而血清学方法则不能。PFLP组织配型为器官移植骨髓移植选择适宜的供体,用比较供体,受体限制酶切片段的长度的差异。两者的RFLP越接近。差别越小,移植效果越好,近年来发展的PCR-RFLP以其简单、敏感、可靠、价廉且无需同位素等优点,已取代了RELP法。

32 细胞免疫功能的检测 | 免疫治疗学 32
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