生物化学与分子生物学/目的序列与载体的连接

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生物化学与分子生物学

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将目的基因或序列插入载体,主要靠DNA连接酶和双链DNA粘末端单链序列互补结合的配合使用。有以下主要的方式。

一、粘性末端连接

如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点,则同一限制酶切开产生的粘末端,在降低温度退火时,能重新互补结合,在DNA连接酶催化下,目的序列就与载体DNA链相连接(见图20-5)。

同一限制酶切割DNA粘性末端的连接


图20-5 同一限制酶切割DNA粘性末端的连接

不同的限制性内切酶切,如果产生的DNA的粘末端相同,也同样可用此法连接,如识别6bp序列的BamHⅠ和识别4bp序列的Sau3aⅠ切割DNA后都产生5’突出粘性末端GATC,可以互补结合连接。

如果在连接的两个DNA片段没有能互补的粘性末端,可用末湍核苷酸转移酶催化脱氨单核苷酸添加DNA的3’末端,例如一般DNA3’端加上polyG,另一股DNA加上polyC,这样人工在DNA两端做出能互补的共核苷酸多聚物粘性末端,退炎后能结合连接(图20-6),这样方法称为同聚物加尾法。

同聚物加尾连拉法


图20-6 同聚物加尾连拉法

对平末端的DNA,也可先连上人工设计合成的脱氧寡核苷酸双链接头,使DNA末端产生新的限制内切酶位点,经内切酶割后,即可按粘性末端相连(图20-7)。

人工接头连接法


图20-7 人工接头连接法

二、平末端连接

T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用,用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合,则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端,再用T4DNA连接酶连接,但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。

32 动物病毒载体 | 目的基因序列的来源和分离 32
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