生物化学与分子生物学/基因序列导入细胞

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生物化学与分子生物学

生物化学与分子生物学目录

目的基因序列与载体连接后,要导入细胞中才能繁殖扩增,再经过筛选,才能获得重组DNA分子克隆,不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖,导入细胞的方法也不相同。

一、转化

由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化,早在1943年,Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。但DNA进入细胞的效率很低,在分子生物学基因工程工作中可采取一些方法处理细胞,经处理后的细胞就容易接受外界DNA,称为感受态细胞,再与外源DNA接触,就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理,就成为感受态细菌,当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理,质粒DNA就能进入细菌;用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显着提高转化效率,这称为电穿孔(electroporation)转化法。

二、感染

噬菌体进入宿主细菌,病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染(infection)。用经人工改造的噬菌体活病毒作载体,以其DNA与目的序列重组后,在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒,就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞,使目的序列得以复制繁殖。感染的效率很高,但DNA包装成噬菌体或病毒的操作较麻烦。

三、转染

重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌,即宿主菌先经过CaCl2,电穿孔等处理成感受态细菌再接受DNA,进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖,这种方式称为转染(transfection)。M13噬菌体DNA导入大肠杆菌就常用转染的方法。重组DNA进入宿主细胞也常用转染方式。最经典的是1973年建立的磷酸钙法,其利用的基本现象是:DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时,培养细胞摄取DNA的效率会显着提高。用电穿孔法处理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取DNA能力,但所用外加电场的强度、电脉冲的长度等条件与处理细菌者都很不相同。近年来用人工脂质膜包裹DNA,形成的脂质体(Liposome)可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞,方法简单而有效,现有商售的脂质体试剂,使用日益广泛。

32 目的基因序列的来源和分离 | 目的基因序列克隆的筛选与鉴定 32
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