基因诊断与性病/PCR方法

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基因诊断与性传播疾病

基因诊断与性传播疾病目录

(一)试剂

(1)引物:决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同,选用不同引物,每种病原微生

物都有自己特异的引物。

(2)耐热的DNA聚合酶:此酶是从耐热细菌中分离出来的,能耐受高温90℃-100℃。

(3)10×PCR缓冲液:500mmol/l KCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。

(4)5mmol/L dNTP贮备液:将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并,加入灭菌去离子水溶解,用NaOH调pH至中性,分装每份300μl,-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。

(5)DNA模板:用处理液将待测标本处理,不同处理方法、操作各异,但目的是暴露标本中被检测的DNA。

(二)操作程序

过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中,然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下:

(1)向一微量离心管中依次加入

DNA模板 102-105拷贝

引物  各1μmol/L

dNTP    各200μmol/L

10×PCR缓冲液1/10体积

ddH2O 补到终体积(终体积50μl-100μl)

混匀后,离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用,现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液,引物,ddH2O混合在一起,反应体积为20-25μl,只要试验人员加入处理好的样品就可以了。

(2)加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。

(3)冷至延伸温度时,加入1-5u Taq DNA聚合酶,离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。

(4)PCR的循环程序为:94℃变性30s,55℃退火20s,然后在72℃延伸30s,共循环30-35次。最后一次循环结束后,再将反应管置72℃温育5min,以确保充分延伸。

PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解,就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA,再用PCR进行特异性的DNA扩增,应用这种方法,他们成功地从保存30至40年久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA,操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚,0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂,离心除去二甲苯,用400μl 95%乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质,将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min,然后按前述PCR方法进行DNA扩增。

在应用PCR方法检测RNA病毒时,首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增,因为PCR只能对DNA模板进行扩增,我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR,简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录,反转录需要在反转录酶的作用下完成。

32 PCR的特点 | PCR反应的基本条件及其对PCR的影响 32
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