基因诊断与性病/PCR扩增产物的分析法

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PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的,根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小,有助于扩增产物的鉴定,点杂交除可鉴定扩增产物外,还有助于产物的分型;Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小,增加检测的特异性与敏感性,最近发展的一系列产物分析法(PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助于产物的精确分析。

(一)凝胶电泳分析法

PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以前者最常用,通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中,仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解,稍冷后倒入电泳槽。

电泳后,用溴化乙淀染色20min,然后用去离子水漂洗2次,每次min,于UV灯下观察结果并拍照。

凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小,检测扩增的情况,还可以用来纯化扩增产物。

(二)点杂交

当扩增产物是多条带时,用点杂交更合适。这种方法的基本过程是,首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上,再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型,用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑,对人们认识某些疾病基因变异的关系起了很大的作用。但是,由于同位素不稳定和放射性危害,不能常规用于临床或法医检验,用非放射性物质(生物素荧光素地高辛等)标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。非放射性标记物质稳定性高,使用方便、安全、检测速度快。

(三)微孔板夹心杂交

该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后,再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交,漂洗后显色即可判断结果,该法需要两个杂交过程来检测一个产物,因此,其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测,其敏感度可达5个HBvDNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR 32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害,显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。

(四)PCR-ELISA法

本法避免了电泳和杂交的步骤,适于常规ELISA记数仪检测。因为5'端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此,可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因,而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。

32 PCR实验中常见问题对策 | 性传播疾病概论 32
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