细胞免疫检测法

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细胞免疫检测法(assays of cellular immunity),检测参与免疫应答的各种细胞(即免疫细胞)的数量和功能的方法。免疫细胞包括各类白细胞和它们的前体细胞血液中的白细胞是成熟的免疫细胞的代表,可按形态分为淋巴细胞单核细胞(在组织中转变成巨噬细胞)、嗜中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞浆细胞等。基中,淋巴细胞又可藉表面特征和功能的不同再分为 T细胞B细胞K细胞(杀伤细胞)和NK细胞自然杀伤细胞)等。除血液外,大部分免疫细胞分布于身体各免疫器官中。各类免疫细胞都从骨髓造血干细胞分化而来,只有 T细胞在胸腺中成熟,其余细胞都在骨髓中成熟。免疫细胞成熟以后,被分送到血液、脾脏淋巴结或其他淋巴组织行使功能。正常情况下,各免疫器官所含各类免疫细胞的数量和相互比例有一定的正常值范围,其分布有一定的解剖学区域,如T细胞分布于脾脏和淋巴结的胸腺依存区、 B细胞分布于脾脏和淋巴结的非胸腺依存区。各类免疫细胞的正常含量与分布是维持免疫系统正常生理功能的基础。各类免疫细胞能单独或联合地对各种外来的、内生的不利于身体的大分子物质或细胞产生适当的反应,将它们解毒、杀死、吞噬、消化,最后清除体外,以维持身体的内环境稳定,便于正常生理活动的进行。由于免疫系统或其他系统的疾病,由于免疫接种或某些临床治疗措施,由于某些外界环境因素的影响,免疫细胞的数量和功能均可发生变化。这些变化又能引起身体其他生理功能的异常,或导致各种新的继发性病变。因此进行细胞免疫检测,对于某些疾病的诊断和其发病机理的分析,对某些免疫接种或治疗措施的效果评估,对某些环境因素对免疫细胞影响的研究等方面,都具有重要的意义。细胞免疫的检测方法很多,内容、目的及方法的难易程度有很大的不同,必须根据自己的目的和条件选用适当的方法。常用的细胞免疫检测方法如下。

免疫细胞的数量检测

正常情况下,身体各部分各类免疫细胞的含量与分布保持相对稳定。任何疾病或异常原因打乱免疫细胞的新生与破损死亡两过程的平衡,即可造成这些细胞数量与分布的变化。表1列出不同原因引起的免疫细胞数量变化的发生部位及细胞的特性。

各种原因引起的免疫细胞数量变化表现多数都在血液中有所反映。所以,血液是细胞免疫检测法最常选用的样品,只有在必要时,才从骨髓或其他免疫器官取材检查。

①血液白细胞计数。是医院最常用的化验检查项目之一,实际上就是血液中总的白细胞浓度的测定。成人血中白细胞浓度的正常值为4000~10000个/mm3新生儿的正常值较成人高,为11000~20000个/mm3。血液白细胞计数是诊断的依据。若白细胞计数异常,则需要作白细胞分类等检查(见血液常规检查)。

②血液中白细胞的分类计数。正常人体血液中各类白细胞的数量有一定的比例。表2示其特征。

在异常或疾病情况下,不管白细胞总数是否发生改变,各类白细胞之间相对数量的百分率都可能发生变化。这些变化是诊断的依据之一。血中白细胞分类计数方法比较简单,属于医院的常规化验检查项目。取一滴血,在载玻片上做成涂片,经固定染色,即可在显微镜下观察。数100个细胞,计算每一类白细胞的百分率。

③血中T细胞与B细胞的分类计数。在正常人血中,T细胞与B细胞的数目分别占淋巴细胞总数的65~80%和5~15%。若两类细胞的百分数发生变化,应根据淋巴细胞总数来判断这种变化是绝对数还是相对数变化引起的。在进行血中T细胞和B细胞分类计数时,大量红细胞粒细胞的存在给检测带来很大的不便,所以需要将淋巴细胞从血中分离出来,再根据T细胞和B细胞的表面标记不同,对提纯的淋巴细胞作T细胞和B细胞的百分数测定。

不同血细胞的密度有差别,淋巴细胞较轻,比重低于1.077,红细胞、粒细胞和血小板较重,比重高于1.077。若将加有抗凝剂的血放到比重为 1.077的细胞分离液表面上,将装液体的试管离心,红细胞、粒细胞和血小板均沉于细胞分离液之下到达管底,而淋巴细胞和少量单核细胞浮在细胞分离液之上。取出浮在上面的淋巴细胞,即可作T细胞与B细胞百分数的检测。

人的T细胞表面有绵羊红细胞(SRBC)的受体,因此可与绵羊红细胞结合。若将分离提纯的淋巴细胞与过量的SRBC混合,经过离心使细胞紧密接触。在室温或4℃冰箱放置一段时间后,将细胞重新混悬起来,滴一滴细胞悬液在玻片上做成压片,在显微镜下观察。淋巴细胞可成为中心包绕三个以上SRBC,形成细胞集团,形如一个花环(图1)。因红细胞的英文字(erythrocyte)第一个字母是E,所以称这种细胞集团为E-花环。E-花环中心的淋巴细胞就是 T细胞,不结成花环的散在淋巴细胞为非 T细胞。将结花环和不结花环的淋巴细胞分别计数,累计100或200个淋巴细胞即可得知淋巴细胞中含T细胞和非T细胞的百分数。

人的T细胞表面有CD3抗原,B细胞表面有表面免疫球蛋白。将分离提纯的淋巴细胞用抗CD3的抗体免疫荧光“染色”可使 T细胞带上荧光物质;用抗免疫球蛋白的抗体“染色”可以使 B细胞带上荧光物质。带上荧光物质的细胞在一定波长的激发光作用下可以产生荧光,用荧光显微镜或流式细胞计数器,可鉴别发荧光与不发荧光的细胞,并能分类计数。因此,对提纯的淋巴细胞分别用CD3抗体或抗免疫球蛋白的抗体作免疫荧光染色,就可以进行淋巴细胞中含T细胞或B细胞百分数的检测。这种方法比E-花环形成试验的结果要准确一些。

人的 T细胞中带CD4抗原的细胞称T4细胞,带CD8抗原的细胞称T8细胞。T4与T8细胞组成T细胞的两亚类,分别表现不同的免疫功能。在正常人,T4细胞数多于T8细胞数,两者的比例约为2:1,在有些疾病中,其比例可发生变化。获得性免疫缺陷综合征时人免疫缺陷病毒侵犯T4细胞,引起T4细胞减少,可出现T4细胞与T8细胞比例倒置(小于1)的现象。对T4和T8细胞计数的方法,与对T细胞和B细胞的计数方法相似,可用抗CD4的抗体或抗CD8的抗体,分别对提纯的淋巴细胞或T细胞进行免疫荧光染色,再用荧光显微镜或流式细胞计数器计数。

免疫细胞的功能检测

在自然条件下,免疫细胞的功能都是在体内完成的。但在进行免疫细胞功能检查时,主要采用体外实验的方法。其基本过程是,从待检查者分离欲检测的细胞,用适当的刺激物或单纯的营养液与细胞一起培养,观测细胞发生的与体内功能有关的反应性变化。根据所用刺激物的性质不同,可将试验分为特异性反应功能和非特异反应功能检测两类。

淋巴细胞转化试验。是淋巴细胞功能检测最基本的方法。淋巴细胞平常在未受到刺激时,处于相对的代谢静止状态。在体外培养的淋巴细胞受到某些刺激物的作用后,经过3~5天,可发生形态学的变化,胞浆增多,胞核扩大,继而出现有丝分裂。这些变化称为淋巴母细胞样转化现象或淋巴细胞增殖反应。在淋巴细胞发生母细胞样转化的过程中,细胞的蛋白质RNADNA的合成都增加,出现代谢活化现象。因此,在进行淋巴细胞转化试验时,可用形态学的方法或生物化学的方法来检测试验结果。淋巴细胞转化试验可根据所用刺激物的不同分为三种。一为促有丝分裂素引起的淋巴细胞转化反应。促有丝分裂素为一些来自植物或微生物糖蛋白多糖物质,能非特异地作用于正常人的淋巴细胞,引起淋巴细胞转化反应。适用于人的淋巴细胞转化试验的促有丝分裂素有五种,即植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、美洲商陆 (PWM)、金黄色葡萄球菌CowanⅠ株(SAC)、乙型副伤寒杆菌 (SPB)。它们引起T细胞和B细胞转化的能力有不同。检测之前,各实验室需测定正常人 T细胞和B细胞转化反应的均值与正常范围,作为比较的标准。

特异性抗原引起的淋巴细胞转化反应。在正常人体内能与某一种特异抗原结合的淋巴细胞在全体淋巴细胞中只占很小的比例,约为几十万分之一。所以正常人的淋巴细胞几乎不能对抗原发生可测的转化反应。人体接受某种抗原的刺激后,能与相应抗原结合的淋巴细胞在体内发生活化和增殖,转变为数量较多对抗原反应明显的致敏淋巴细胞。因此,受过抗原刺激的人,其淋巴细胞含有较多的致敏淋巴细胞,在体外与特导抗原一起培养便可发生淋巴细胞转化反应。抗原引起的淋巴细胞转化试验,在于检测人体是否已经接受过某种抗原的刺激。

混合淋巴细胞培养 (MLC)反应。是将组织相容性抗原( HLA抗原)不同的两个人的淋巴细胞放在一起培养时,发生的淋巴细胞转化现象。在MLC反应中,T细胞是反应细胞,HLA抗原不同的异体B细胞是刺激细胞。如果二人的HLA抗原完全相同,则不会发生MLC反应,或者称为MLC反应阴性。在某些疾病时,T细胞的免疫功能下降,病人对HLA抗原不同的人淋巴细胞发生MLC反应的能力也减弱。

淋巴因子产生试验。淋巴细胞在受到各种刺激后发生代谢的活化,同时可产生并释放多种有生物学活性的物质,称为淋巴因子。因此,淋巴因子产生试验与淋巴细胞转化试验具有相似的意义,用来检测淋巴细胞对不同刺激物的反应能力。较常用的淋巴因子产生试验是白细胞移动抑制因子(或巨噬细胞移动抑制因子)产生试验。白细胞移动抑制因子和巨噬细胞移动抑制因子分别能抑制装在毛细玻璃管中的白细胞或巨噬细胞向管口外移动。在作白细胞(或巨噬细胞)移动抑制因子产生试验时,一般是用特异性抗原作刺激物,若淋巴细胞能发生反应释放白细胞移动抑制因子或巨噬细胞移动因子,说明此人已接受过该抗原的刺激,对该抗原可表现特异的细胞免疫反应。此试验的结果,往往与身体对同一抗原的迟发型过敏皮肤试验的结果一致。

③细胞介导的细胞毒试验。一种细胞通过直接接触将另一种细胞杀伤的现象,称为细胞介导的细胞毒作用。前种细胞为杀伤细胞,后种细胞为靶细胞。在人体内有两种能直接杀伤靶细胞的细胞,即自然杀伤细胞(NK细胞)和特异性杀伤 T细胞(特异性Tc细胞)。NK细胞可存在于未受抗原刺激的正常人体,对某些受感染的细胞、肿瘤细胞或正常的未成熟造血细胞有杀伤活性。特异性Tc细胞存在于受过特异抗原刺激的人体内,能杀伤带特异抗原的受感染细胞、异体细胞、自身组织细胞或肿瘤细胞。这两种杀伤细胞借不同的机制在抗感染免疫抗肿瘤免疫自身免疫病移植免疫的过程中均有重要意义。两种杀伤细胞在体外的功能检测,只是所用的靶细胞各不相同,检测的方法都是相同的,常用放射性核素51铭(51Cr)释放法。此方法的原理是,将靶细胞预先用51Cr标记,51Cr能与胞浆中的蛋白质结合。靶细胞标记的51Cr量可用γ射线计数器测量其cpm值来表示。靶细胞与杀伤细胞混合后经过离心,使两种细胞压紧,密切相互作用。培养一段时间后,被杀伤靶细胞内的51Cr会释放到胞外来,可以测量细胞培养液中游离51Cr的 cpm值,以表示靶细胞受破坏的程度(图2)。因此,可用培养后所测培养液中的cpm值与靶细胞标记的总 51Cr量的 cpm值之比表示杀伤细胞对靶细胞的杀伤率(又称 51Cr的特异释放率)。靶细胞的51Cr特异释放率即被杀伤百分率,与杀伤细胞的数量与杀伤速度成正相关,所以可用此测量结果作为杀伤细胞功能强弱的指标。

④抗体分泌细胞的检测。分泌抗体的浆细胞由 B细胞分化而来,但在此分化过程中,往往需要T细胞与单核—巨噬细胞协作。因此对抗体分泌细胞的检测,实际上是对B细胞、T细胞和巨噬细胞功能的综合性评价。抗体分泌细胞的检测,依抗体的特异性不同,可分为针对某种抗原的特异抗体分泌细胞的检测,以及无一定特异性的免疫球蛋白分泌细胞的检测。抗体分泌细胞的检测还可因其产生的条件不同而分为三种方法,其结果表示的意义也有差别。在自然条件下人体内存在的免疫球蛋白(Ig)分泌细胞,称为自发性Ig分泌细胞。它们反映人体在自然情况下受抗原刺激的情况,并且与年龄的增长有关。受抗原注射后,在体内产生的特异抗体的分泌细胞,能反映人体的体液免疫应答功能。但是,对人无益的抗原不能轻易给人注射,此方法多用于动物试验。取人的淋巴细胞,在体外培养,经过各种刺激,能够引起非特异性Ig分泌细胞的产生,称为体外的抗体产生免疫应答。此体外试验对于分析T细胞、B细胞和巨噬细胞在抗体产生反应中的功能作用很有意义。抗体分泌细胞的具体检测常用溶血空斑技术,即将待检细胞与经过处理的绵羊红细胞混合,再加入补体及显斑剂,灌入用两张玻璃片做成的窄缝状小室内。经过37℃培养一段时间,抗体分泌细胞周围的绵羊红细胞被溶解,形成一个圆形的透明区,称为溶血空斑。空斑中心的抗体分泌细胞又称为空斑形成细胞(PFC)。所以抗体分泌细胞的检测也称PFC的检测。

⑤嗜中性粒细胞吞噬功能的检测。血液白细胞中占比例最大的就是嗜中性粒细胞,能作较快的变形运动,有对异物的吞噬作用。对嗜中性粒细胞吞噬功能的检测常用形态学检查方法。将抗凝的血1~2ml经过离心沉淀,取出压积细胞表面的白细胞层(可混入一些红细胞),将此细胞与一定数量的细菌悬液混合,于37℃培养一段时间。用低速离心方法洗去白细胞外的细菌,将白细胞作涂片染色,于显微镜下观察。顺序观察100~200个嗜中性粒细胞,并记下吞噬细菌的细胞数及被吞噬的细菌数。100 个嗜中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数称为吞噬百分率。在100个白细胞中,平均每个细胞吞噬的细菌数称为吞噬指数。在对人或动物作嗜中性粒细胞吞噬功能检测时,常需要同时计算出吞噬百分率和吞噬指数以综合评价其吞噬功能。

⑥嗜中性粒细胞 NBT还原试验。嗜中性粒细胞在吞噬细菌或异物后,还需要消化分解异物。这种能力与葡萄糖在细胞内的氧化分解有关,在葡萄糖氧化脱氢的过程中,可以产生硝基蓝四氮唑(NBT)还原的反应。正常人的嗜中性粒细胞在吞噬异物后,可发生与消化异物相关的糖氧化分解反应,若在体外遇到NBT,即可使NBT由黄色变成蓝色的颗粒沉积于胞浆内。慢性肉芽肿的患者,其吞噬细胞的吞噬作用表现正常,但对吞噬的异物缺乏消化分解的能力。用这些人的嗜中性粒细胞做 NBT还原试验,呈现阴性反应,即胞浆中不出现蓝色颗粒,或只有很少的蓝色颗粒。此外,在细菌感染时,NBT还原试验呈阳性的吞噬细胞增加。

⑦巨噬细胞吞噬功能的测定。巨噬细胞是重要的免疫细胞,具有处理与传递抗原、产生白细胞介素1和其他细胞因子,以及吞噬异物或异常细胞的功能。巨噬细胞功能的检查在动物进行的研究较多,在人的研究较少,因为从人体获得巨噬细胞困难。中国张友会等人利用含有斑蝥浸出液的滤纸片贴于人的皮肤,引起皮疱,从皮疱液中可得到较多的巨噬细胞,这为进行人的巨噬细胞的研究提供了方便。巨噬细胞的体积大、吞噬力强,可用羊或鸡的红细胞作为吞噬作用的指标,检测巨噬细胞的吞噬功能。这比用细菌作吞噬的指标较易观察结果。

细胞免疫功能体内测定技术

如延缓型皮肤变态反应,又称(迟发型超过敏反应)包括结核菌素试验二硝基氯苯(DNCB)或二硝基氟苯(DNFB)皮肤试验。结核菌素试验是以不同类型的结核菌素和不同方法进行的皮肤试验,用以诊断结核病及细胞免疫缺陷病的参考。试验用旧结核菌素(OT)或纯蛋白衍化物(PPD),多用将试剂体内注射的芒图氏法。隔一段时间视局部有无红晕、硬结,观察人体对结核菌素有无延缓型变态反应(Ⅳ型)。阳性者表示过去或现在接触过结核杆菌,但不一定有活动性结核;阴性表示无结核感染,结核感染早期或病情危重、营养极度不良、某些急性传染病(如麻疹)、恶性肿瘤时均可表现阴性。给小儿接种卡介苗前应先做结核菌素试验,阴性者方可接种。

二硝基氯苯和二硝基氟苯以致敏剂量涂于前臂,48~72小时后局部可见红晕、硬结乃至大疱溃疡,表现似结核菌素试验,这也是延缓型变态反应。正常人多呈阳性,但细胞免疫缺陷者反应减低或为阴性。此法用于测定肿瘤患者的细胞免疫功能。但因该试剂副作用大,现已很少用。

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