组织学/组织化学和细胞化学术

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组织化学(histochemistry)和细胞化学(cytochemistry)技术是通过化学物理反应原理显示组织切片细胞内某种化学成分,进行定位、定量及其与功能相关的研究。如糖类、脂类、酶、核酸等与试剂发生化学物理反应,形成有色终末产物,在光镜下观察,有的可在电镜下观察。

1.糖类显示多糖蛋白多糖的常用方法是过碘酸-雪夫反应(periodic acid Schiff reaction,PAS反应)。基本原理是过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基变为乙二醛基,后者继而与Schiff试剂(无色亚硫酸品红复合物)结合,形成紫红色反应产物(图1-3)。颜色反应的深浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡。

PAS反应原理示意图


图1-3 PAS反应原理示意图

2.脂类脂类物质包括脂肪和类脂。标本甲醛固定,冷冻切片,脂类保存较好。多用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色,使脂质呈色。也可用四氧化锇(OSO4)染色,脂肪酸或胆碱可使OSO4还原为OSO2而呈黑色。

3.酶细胞内的酶种类甚多,有氧化还原酶水解酶合成酶转移酶等几类,目前已有100多种酶组织化学染色法。酶组化反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用,然后再使底物的反应产物与某种捕获剂发生反应,形成沉淀或有色的最终产物,借此检测该酶在组织切片或细胞内的分布及活性强弱。如细胞磷酸酶是一种重要的水解酶,碱性磷酸酶ALP)和酸性磷酸酶ACP)在合适的pH条件下可水解有机磷酸脂。小肠上皮细胞表面的纹状缘和肾近曲小管表面的刷状缘处,微绒毛含有丰富的ALP,与物质的吸收和转运功能相关;许多细胞的溶酶体内则含大量ACP,参与细胞内物质代谢。这两种酶均可以β-甘油磷酸钠为底物,底物被水解产生磷酸根,再以Ca2+、Co2+(显示ALP)或Pb2+(显示ACP)捕获磷酸根,最后用硫化铵处理,即形成硫化钴或硫化铅黑色最终产物,出现在组织切片中该酶存在的部位。因此,酶组化染色不是酶本身的直接显色,而是酶作用底物的化学反应产物显色的。

4.核酸 显示DNA的传统方法是Feulgen反应,切片先用稀盐酸处理,使DNA分子中脱氧核糖与嘌呤之间的连接键打开,形成醛基,再与Schiff 试剂作用,原理同PAS反应,使细胞核DNA显紫红色。还可用甲基绿-焦宁染色法同时显示DNA和RNA,这两种染料都是碱性,甲基绿使细胞核内的DNA呈蓝绿色,焦宁使细胞质核仁内的RNA呈红色。

免疫细胞化学术示意图


图1-4 免疫细胞化学术示意图

人呼吸道分离上皮细胞粘蛋白免疫荧光像


图1-5 人呼吸道分离上皮细胞粘蛋白免疫荧光像

(美国戴维斯加州大学 吴忍教授供图)

32 几种特殊显微镜的应用 | 免疫细胞化学术 32
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