电泳

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电泳(electrophoresis),荷电颗粒或分子在电场中的泳动。1927年A.蒂塞利乌斯设计完全在液相中泳动的移动界面电泳,开创了电泳法分离蛋白质的先例。 将待分离蛋白质溶液置于U形管中,其上覆以缓冲溶液,两端通以电流。在电泳时,各蛋白质向其相反电极的方向移动,通过光学折射系统,可察见各蛋白质移动的界面。但此法构造复杂,价格昂贵,难以普及使用。随后在固相支持体中进行带状电泳,又设计出等电聚焦电泳、免疫电泳等,电泳技术日臻完美,应用范围日趋广泛。在临床医学中可利用电泳分析电液蛋白质各组分(如血浆脂蛋白)的比例失调,或某组分的丢失(如无γ球蛋白血症),或某异常成分(如异常血红蛋白)的出现,有助于诊断许多疾病。对蛋白尿的鉴别诊断亦颇有帮助。利用双向电泳可将细胞内上千种蛋白质成分分开,这一技术已开始应用于临床医学以诊断疾病。

原理

分子在电场中的泳动速度 (v)决定于其外加电场强度(E),以及与其分子的大小形状关连的摩擦系数(┃)和荷电状况(q)

v=Eq/┃

在电泳过程中,外加电场强度 (E)是恒定的,分子的泳动速率(μ,单位电场下的迁移速度)等于q/┃,分子荷电多,颗粒小,呈球状(而非纤维状)者,泳动速率快;反之则慢。故电泳可将各种不同的蛋白质分开,通过染色可显出各蛋白质的区带。鉴于同种蛋白质分子在同一电泳条件下的泳动速率必然相同,因此电泳可用以确定蛋白质的纯度;若与已知的标准蛋白质同时电泳,还可鉴定该蛋白质。

种类

电泳可按不同的标准分类:

①  按照电泳支持体的不同,发展成各种带状电泳。如支持体为滤纸者称纸上电泳,其他的支持体尚有醋酸纤维薄膜,淀粉凝胶,聚丙烯酰胺凝胶(由丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚合而成,因二者的浓度及比例不同,可构成大小不同的凝胶孔径),以及琼脂糖凝胶等(因琼脂糖凝胶孔径大,适用于分离大分子核酸)。通常血浆蛋白质在纸上电泳或醋酸纤维薄膜电泳中,可分成清蛋白、α 球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白诸带;而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中则可进一步分成三十余条带。

②  按照分子的荷电状况的不同,发展成二类。等电聚焦电泳(IEF),是将两性电解质固定于支持体上,外加电场时,因处于各部位上的两性电解质受两端电场强度的影响不同,其解离状态不一,形成了一系列的pH梯度。当蛋白质泳动至某部位,该部位的pH正好与其等电点相同时,该蛋白质就在该处停留不动,这样可将不同等电点的蛋白质分开。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 这是蛋白质在含有十二烷基磺酸钠 (SDS)的缓冲液中进行电泳。蛋白质分子均因带上SDS而荷负电。 平均每克蛋白质约结合1.4克SDS,且蛋白质的三维结构均被破坏而变性伸展,形状一致,因此泳动速率只与分子的大小有关。可借以测定蛋白质的分子量

③  联合两种不同的电泳方式。 双向电泳即 SDS-IEF凝胶电泳。这是基于IEF对泳动率的决定因素是分子的电荷;而 SDS电泳则是基于分子量的大小。故若首先进行IEF,然后换成垂直方向,进行SDS电泳,两者配合,在同一张凝胶片上可同时分离上千种蛋白质,转移电泳。这是因为在凝胶电泳后难以用免疫化学酶反应染色,也难以对核酸进行杂交鉴定。乃通过转移电泳,将凝胶上已分开的各带,通过转移电泳,转移至硝酸纤维素薄膜上,方可进行特殊染色,或分子杂交,或进一步进行序列分析等。

近年来电泳技术更向微量化,快速化,自动化及高分辨力发展,如毛细管电泳等,成为生物化学实验研究中最重要的手段之一。

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