层析

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层析(chromatography),待分离化合物在固定相和流动相间进行分布的技术。易被固定相吸引的成分,其流速较慢;反之易溶于流动相不易进入固定相的成分,其流速较快,因此各待分离物质洗脱时先后有序得以分离。通常将固定相填装柱中,这称为层析柱。流动相流经层析柱,分段收集流洗液进行检测。

1855年,德国F.F.龙格将染料混合物滴于滤纸上,注意到不同颜色环的形成。1897年D.T.戴首先用填充石灰石的层析柱以分段分离粗石油制品。此后,不同性质的层析技术不断创建,应用十分广泛,不仅在生物活性物质的分离、分析、纯化、制备中不可或缺,临床医学中也可利用高效液相层析法检测体液中含量极微、难以用一般化学方法分析的许多激素维生素代谢物、药物和毒物等。

原理

按照待分离化合物与固定相/流动相的相互作用性质的不同,层析原理也各异。①吸附层析。待分离物质被固定相吸附,然后用流动相洗脱之,混合物中各成分洗脱次序的先后,决定于它在固定相中吸附的能力及在流动相中的溶解度。常用的固相吸附剂有氧化铝、活性炭淀粉羟磷灰石等。洗脱液多用苯、石油醚等有机溶剂,或缓冲盐溶液。②分配层析。待分离物质在两种互不混溶的液相中进行分配,其中一种液相束缚于惰性支持物上,成为固定相;另一液相则为流动相。当流动相流经固定相时,易溶于流动相(不易溶于固定相)的物质乃先行洗脱。常用的能束缚液相的惰性支持物有滤纸、硅胶、纤维素等。③凝胶过滤层析。由交联葡聚糖琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶等惰性介质,制成不同孔径的微小颗粒,悬浮成胶。当待测物质流经层析柱时,分子小者可钻入胶粒的小孔内,在流洗过程中,流洗出来较晚;而分子大者不能(或不易)进入胶粒的小孔内,将随流洗液较早地被流洗出来。因此层析柱可起到分子筛的作用。④离子交换层析。解离基团结合在固定相中,在一定pH下带一定的电荷(如阳电荷);待分离化合物中在此pH下带有相反的电荷者(如阴离子),即可与之相互吸引而滞留,然后可改变流洗液的pH或离子强度以洗脱之。待分离化合物中的阴离子能被吸引滞留者,称阴离子交换层析,反之则为阳离子交换层析。新设计的聚焦层析,可按各蛋白质等电点的不同而一一分离之。⑤亲和层析。利用抗原抗体,酶与抑制物或配体受体间的特异性的高度亲和力,可以将一方(如抗体)结合于固定相中,用以分离相对应的另一方(如相应的特异抗原),然后通过改变流洗液的pH值及/或离子强度以解离特异性结合的物质(如抗原)。

种类

可按以下四个标准分类:①按待分离化合物与固定相/流动相的相互作用的性质区分,可分成吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析、共价层析及聚焦层析等。②按固定相与流动相状态的不同,可分成固-液体系(如吸附层析)、液-液体系(如分配层析)及气-液体系(即流动相为气相的气相层析)。③按流洗压力的不同,可分成常压、中压及高压液相层析。④按固相支持物填装方式的不同,填装成柱者称柱层析(见图),平铺在薄板上者称薄层层析

自从高效液相层析问世以来,层析技术获得革命性的变化,不仅可在较短时间内,高效、精细地分析微量物质,还能快速分离纯化较大规模的制备量。将高效液相层析与质谱联用,气相层析与质谱联用(GC-MS),或层析与电泳联用,则效果更佳。

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