临床生物化学/离心分离方法

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(一)差速离心

它利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开,然后将上清液加高转速离心,分离出第二部分沉淀,如此往复加高转速,逐级分离出所需要的物质。

差速离心的分辨率不高,沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开,常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份

差速离心法分离已破碎的细胞各组份


(二)速率区带离心

速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖甘油、KBr、CsCl等),待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间,同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处(X1)的介质密度最小,离旋转轴最远处(X2)介质的密度最大,但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度,即ρP>ρm。这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后,取样时起着支持介质和稳定剂的作用,避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。

由于ρP>ρm可知S>0,因此该离心法的离心时间要严格控制,既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带,又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长,所有的样品可全部到达离心管底部;离心时间不足,样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降,沉降受物质本身大小的影响较大,一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

(三)等密度离心

等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度,此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度,待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合,离心开始后,当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度,与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度,即ρm>ρP时粒子上浮;在弯顶处ρP>ρm时,则粒子沉降,最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP=ρm,此时dx/dt为零粒子不再移动,粒子形成纯组份的区带,与样品粒子的密度有关,而与粒子的大小和其他参数无关,因此只要转速、温度不变,则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

此法一般应用于物质的大小相近,而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。

(四)梯度溶液的制备

⒈梯度材料的选择原则作为一种理想的梯度材料应具备以下几点:①与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性,且易与所分离的生物粒子分开。②可达到要求的密度范围,且在所要求的密度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和pH变化较小。③不会对离心设备发生腐蚀作用。④容易纯化,价格便宜或容易回收。⑤浓度便于测定,如具有折光率。⑥对于超速离心分析工作来说,它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这些条件是理想条件,完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料:①糖类:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐糖原。②无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等。③有机碘化物:三碘苯甲酰葡萄糖胺(matrizamide)等。④硅溶胶:如Percoll。⑤蛋白质:如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有机物:如氟代碳等。

⒉梯度材料的应用范围

⑴蔗糖:水溶性大,性质稳定,渗透压较高,其最高密度可达1.33g/ml,且由于价格低容易制备,是现在实验室里常用于细胞器病毒RNA分离的梯度材料,但由于有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。

⑵聚蔗糖:商品名Ficoll,常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000,Ficoll渗透压低,但它的粘度却特别高,为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞成纤维细胞肿瘤细胞鼠肝细胞等。

⑶氯化铯:是一种离子性介质、水溶性大,最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类,在离心时形成的梯度有较好的分辨率,被广泛地用于DNA质粒、病毒和脂蛋白的分离,但价格较贵。

⑷卤化盐类:KBr和NaCl可用于脂蛋白分离,KI和NaI可用于RNA分离,其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白,NaI梯度可分离天然或变性的DNA。

⑸Percoll:是商品名,它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮(PVP),渗透压低,它对生物材料的影响小,而且颗粒稳定,在冷却和冻融情况下还是稳定的,其粘度高,且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。

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