临床生物化学/分析性超速离心

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与制备性超速离心不同的是:分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构,而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段,以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。

(一)分析性超速离心的工作原理

分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置,此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转,其容纳二个小室:分析室和配衡室。配衡室是一个经过精密加工的金属块,作为分析室的平衡用。分析室的容量一般为1ml,呈扇形排列在转子中,其工作原理与一个普遍水平转子相同。分析室有上下二个面的石英窗,离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质,可以通过对紫外光的吸收(如对蛋白质DNA)或折谢率的不同对沉降物进行监视。后一方法的原理是:当光线通过一个具有不同密度区的透明液,在这些区带的界面上产生光的折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜,结果在检测系统的照相底板上产出一“峰”。由于沉降不断进行,界面向前推进,故“峰”也在移动,从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。图16-5是分析性超速离心系统的示意图。

(二)分析性超速离心的应用

⒈测定生物大分子的相对分子重量测定相对分子重量主要有三种方法:沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中应用最广的是沉降速度,超速离心在高速中进行,这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动,在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面,该界面随时间的移动而移动,这就是粒子沉降速度的一个指标,然后用照相记录,即可求出粒子的沉降系数

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分子或粒子的相对分子重量则可从Svedberg方程式来确定:

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分析性超速离心系统图示


图16-5 分析性超速离心系统图示

式中M:该分子不含水的相对分子重量;R:气体常数;T:绝对温度;S:分子的沉降系数;ν:分子的微分比容(当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积);ρ:溶剂的密度。

⒉生物大分子的纯度估计静分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一,出现单一清晰的界面一般认为是均质的,如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。

⒊分析生物大分子中的构象变化分析性超速离心已成功地用于检测大分子构象的变化,例如DNA可能以单股或双股出现,其中每一股在本质上可能是线性的,也可能是环状的,如果遇到某种因素(温度或有机溶剂)DNA分子可能发生一些构象上的变化,这些变化也许可逆、也许不可逆,这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。

32 离心分离方法 | 层析技术的应用 32
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