超速离心机

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超速离心机

(一) 概述

离心机是借离心力分离液相非均一体系的设备。根据物质的沉降系数、质量、密度等的不同,应用强大的离心力使物质分离、浓缩和提纯的方法称为离心。一般说,离心机转速在20 000r/min以上的称为超速离心。离心技术,特别是超速离心技术是分子生物学、生物化学研究和工业生产中不可缺少的手段。

1924年T.Svedberg和Rinde研制出世界上第一台涡轮超速离心机以来,发展非常迅速,现在已广泛地应用到科学研究和生产的各个领域。现在离心机转头最高转速已达100000 r/min,最大离心力达700 000 g。

离心机作为一种手段,具有许多优点。例如,超速离心可在低温下操作,保护了生物大分子的活性。制备型的离心机负载量大,一次可分离提纯几克样品,比层析、电泳上的样品量大得多。分析离心机不仅可测物质的分子量,还可检验物质的纯度、构象、沉降系数等。因此离心技术在生物学研究中占有重要的地位,是分离、纯化细胞病毒蛋白核酸和酶的最方便最有效的工具。

(二) 离心原理

当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时,由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重,下沉越快,反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移

动的速度与微粒的大小、形态和密度有关,并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒,直径为数微米,就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。

此外,物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比,颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的,有条件的,要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比,颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等,它们在溶液中成胶体或半胶体状态,仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢,而扩散现象则越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力,才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。

离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力,加快液体中颗粒的沉降速度,把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ω,r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r,cm)。它们的关系是:F=ω2R

为方便起见,F常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g (约等于9.8m/s2.)得到离心力是重力的多少倍,称作多少个g。例如离心机转头平均半径是6cm,当转速是60 000r/min时,离心力是240 000×g,表示此时作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的24万倍。

因此,转速r/min和离心力g值之间并不是成正比关系,还和半径有关。同样的转速,半径大一倍,离心力(g值)也大一倍。转速(r/min)和离心力(g值)之间的关系可用下式换算:

RCF=F离心力/F重力=mω2r/mg= ω2r/g = (2πr/r×rpm)2r/g(注意单位统一换算为标准单位)

式中:r为半径(cm),g为离心力(g值)

(三)超速离心机的离心方法

用离心方法分离生物大分子和亚细胞物质的基本原理是根据它们在液体介质中或者沉降速度不同而形成不同的区带,或者它们的密度不同而停留在液体介质中不同的位置而把它们一一分开。前者是沉降速度法,应用该法时液体介质的最大密度要小于样品中最小颗粒的密度,离心时选用高转速和短时间;后者是沉降平衡法,应用该法时液体介质的最大密度要大于样品中最小颗粒的密度,离心时选用较低转速和较长时间。实际操作有几种形式:

1.差速离心 这种方法是选择不同转速的离心,分别分离各个不同组分。例如先用低速沉降大颗粒和上清液,在高速离心上清沉降中等颗粒,最后超速离心上清沉降小颗粒。采用逐级提高离心力分离上情液的方法,把不同大小的颗粒分开。

这种方法比较简单,方便。分离的组份沉到管底,因此可以迅速浓缩所要的组份,减少体积。但回收率和纯度是有矛盾的,要提高回收率,势必提高转速或延长离心时间,这样大小相近的颗粒也会沉到管底。因此该法多用于粗提纯或初步浓缩样品。

2.速度区带(或速度梯度)离心 本法是将样品放在一个连续的密度梯度液体上,通过离心,大颗粒沉降快,小颗粒沉降慢。经过一段时间,相同的颗粒就在同一深度

形成一条带子,因此把各种组份分开来。它适用于分离密度相同、而大小不同的物质,如不同的蛋白质组份密度都差不多,但分子量不一样,用本法很容易将其分

开。但对密度不同、大小类似的物质则不易分离。

蔗糖梯度是一种常用的介质。用不同浓度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度,用于梯度离心。再分别进行收集处于不同区带里的各个组份。

3.沉降平衡离心 这是静力学的方法。在离心管中形成一个液体梯度,在离心时各组份以不同的速度下沉,但最终停留在与自己相同的密度中,形成一条狭窄的平衡带,并保持相对的稳定。为了使样品所有组份都能达到它们的平衡位置,需要长时间离心。这种方法适用于分离大小相似但密度不同的物质,如核酸的分离。氯化铯梯度是常用于平衡离心的介质,分辨率很高,可区别密度相差0.05的组分,但离心时间需十几到几十小时,且价格很贵。现在已有一种商品名叫"Percoll"的聚蔗糖溶液可以代替氯化铯梯度。该介质能迅速形成梯度,使离心时间大大缩短到1-2h而仍有很好的分离效果。并且有配套的标记珠(Density marker beads)可以测定样品的密度。

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