DNA重组技术

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DNA重组技术(DNA recombinant technology),将不同来源的DNA片段共价整合到有复制功能的DNA中去的技术。又称分子克隆。该重组的 DNA分子可在寄主细胞中复制、扩增,并转录表达出与该外源性DNA相应的信使RNA蛋白质

DNA重组技术的主要步骤是:

①  选择并分离能携带外源性 DNA的载体。常用的DNA载体有细菌质粒(染色体外DNA),或噬菌体DNA,如大肠杆菌质粒CoLEI及pBR322;λ噬菌体及M13噬菌体DNA等,它们都能插入(或整合)一定长度的外源性DNA片段,并能在寄主细胞中自我复制。

② 以限制性内切酶特异性水解打开载体的双链DNA,使之具有特定的序列末端。不同的限制性内切酶能识别并水解打断双链 DNA中的特定序列处,如限制性内切酶ECoRI能识别下列结构并加以水解切断。

      (打断处)
      ↓
   ………GAATTC………
 ………CTTAAG………
       ↑
    (打断处)

③  制备拟整合入质粒中的外源性DNA片段(即“目的基因”),使其末端与上述经限制性内切酶切割后的载体DNA末端,具有互补的序列结构,便于粘合。

④  将该具有互补序列结构的外源性DNA片段,通过连接酶整合入载体DNA中。若载体是质粒,则在整合入外源性DNA片段后,仍重新连接成环状质粒。

⑤  将此重组DNA引入寄主细胞中,使其复制和扩增。常用的寄主细胞为大肠杆菌及酵母,近已发展到用高等植物细胞及哺乳动物细胞。这类寄主细胞业经变异处理,使之丧失降解外源性DNA的能力。将载体DNA往氯化钙磷酸钠处理,使成DNA-磷酸钙微粒,就易被寄主细胞内吞而转染之。亦有用核内注射法或高压电膜击穿法以引入载体DNA者。

⑥  通过一定的方法筛选能复制此重组 DNA的细胞或菌落。筛选方法的基础是质粒上含有抗药性基因,或利用该菌对某营养素的依赖表型。将该筛选出来的细胞株克隆繁殖,即能不断复制扩增大量的该外源性重组DNA。

1972年,D.A.杰克逊成功地从两种不同生物来源的DNA(病毒SV40分子及λ噬菌体分子),合成了第一个重组DNA分子。1973年S.科恩等成功地使重组DNA分子在寄主细胞内获得表达。这为今后体外大规模生产某特种蛋白质的基因工程的发展奠定了基础,使不少人体中含量极微而十分重要的蛋白质(如某些激素和因子)的生物合成,能体外实现,这对医学和生物学的发展具有划时代的意义。如人胰岛素干扰素乙型肝炎疫苗等已可用重组 DNA技术大规模生产。许多临床诊断用的特异性基因探针,也可通过DNA重组技术的扩增而获得,从而使很多遗传性疾病(如 β-地中海贫血等)及乙型肝炎等的诊断水平前进了一大步。试用重组DNA进行“基因治疗”,将能补偿某些病人对该基因的缺失,此项研究在转基因动物中已实验成功,应用前景诱人。

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