基础检验学/血涂片的制备和细胞染色

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血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法,临床上应用极为广泛,特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值,近年来血细胞分析仪的广泛应用,血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。比台观察10个高倍视野血涂片中白细胞血小板数大致估计血内这些细胞的数量,借以作为仪器结果分析后质控的参考。

但积压涂片制备和染色不良,常使细胞鉴别发生困难,甚至导致错误结论。例如,血膜过厚细胞重叠缩小,血膜太薄白细胞多集中于边缘,细胞分布不匀;染色偏酸或偏碱均可使细胞染色反应异常。因皮制备厚薄适宜,分布均匀,染色良好的血涂片是血液学检查的重要基本技术之一。

血涂片制备方法及注意事项将在实习指导中详细介绍。

1.瑞特(Wright)染色法:为发观察细胞内部结构,识别各种细胞及其异常变化,血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。

(1)瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料,有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐,即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后,产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀,即瑞特染料。

(2)细胞的染色既有物理的吸附作用,又有化学的亲和作用,各种细胞成分化学性质不同,对各种染料的亲和力也不一样。因此,用本染料液染色后,在同一血片上,可以看到各种不同的色彩,例如血红蛋白,嗜酸性颗粒为碱性蛋白质,与酸性染料伊红结果,染粉红色,称为嗜酸性物质;细胞核蛋白淋巴细胞胞浆为酸性,与碱性染料美蓝或天青结合,染紫蓝色,称为嗜碱性物质;中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合,染淡紫色,称为中性物质。

(3)PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质,由于蛋白质系两性电解质,所带电荷随溶液PH而定,在偏酸性环境中下在电荷增多,易与伊红结合,染色偏红;在偏三性环境中负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感,染色用正经片必须清洁,无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇,稀释染色必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则可导致各种细胞染色反应异常,以致识别困难,甚至造成错误。

新鲜配制的染料偏碱,须在室温或是37℃下贮存一定时间,待染料成熟,主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用,贮存时愈久,染色效果愈好。EAm GILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。rA测定方法如下:取瑞特染液15-25μl(视染液浓度而定),加甲醇10ml稀释,混匀后以甲醇为空折管,分别以波长650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm,伊红吸收峰波长为525nm ;天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。所以新配染料rA接近2,随着美蓝逐渐氧化为天青B,RA也相应下降。RA下降到1.3±0.1时即可使用。瑞特染液贮存过程中,必须塞严,以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml,防止甲醇挥发,关可合细胞染色清晰。甲醇必须纯净,如甲醇中丙酮含量过多,染色偏酸,使白细胞着色不良。

2.吉姆萨(Giemsa)染色法:吉姆萨染液由天青,伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好,结构显示更不清晰,而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长,可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液,按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后,再用稀释吉姆萨复染

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