生物化学与分子生物学/噬菌体载体

跳转到: 导航, 搜索

医学电子书 >> 《生物化学与分子生物学》 >> DNA重组与基因工程 >> 基因工程载体 >> 噬菌体载体
生物化学与分子生物学

生物化学与分子生物学目录

噬菌体(phage)是感染细菌的一类病毒,有的噬菌体基因组较大,加入λ噬菌和T噬菌体等;有的则较小,如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。

λ噬菌体由头和尾构成,其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子,组装在头部蛋白质外壳内部,其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时,通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌,而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链,可以两种不同的方式繁殖(图20-3):①溶菌性方式(lyticpathway):在营养充足,条件适合细菌繁殖时,利用宿主菌中的酶类和原料,λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质,λDNA经多次复制合成许多子代λDNA,于是装配成许多子代的λ噬菌体,最后裂菌,释放出许多新的λ噬菌体。②溶原性方式(lysogenic pathway):进入细菌的λDNA可整合(integrate)入细菌的染色质DNA中,随细菌染色体DNA复制,传给细菌后代,这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage),含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的,原噬菌体可从宿主DNA中切出,进入溶菌性方式的繁殖。

λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式


图20-3 λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式

λ噬菌体整个基因组如图20-4所示,可分为三个部分,①左臂:从A到J长约20kb,其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。②中段:长约20kb,是λDNA整合和切出,溶原生长所需的序列。③右臂:长约10kb,是调控区,控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列;对溶菌生长来说,中段是非必需的。

利用λ噬菌体作载体,主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列,使其随左右臂一起包装成噬菌体,去感染大肠杆菌,并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的λ噬菌体载体也是已作过许多人工改造的,主要的改造是:①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。这是因为λDNA较大,序列中的限制性酶切点过多,妨碍其应用。②在中段非必需区,替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ’序列,和多克隆位点等。由此可构建出两类λ噬菌体作载体;一类是插入型载体,可将外来序列插中段,常用的λgt系列载体,一般容许插入5-7kb外来DNA;另一类是转换型载体,即可用外来DNA替代中段,如IMBL系列载体。

野生型λ噬菌体DNA及相应的λ噬菌体DNA图谱


图20-4 野生型λ噬菌体DNA及相应的λ噬菌体DNA图谱

插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的,当噬菌体DNA长度大于野生型λ噬菌体基因组105%或小于78%时,包装而成的噬菌体存活力显著下降。所以λ噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA,这比质粒载体能插入的DNA长得多;而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多,所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。

如果将左右臂和中段都去除,仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列,再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等,就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA,然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体,感染大肠杆菌后,粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。

32 质粒载体 | 动物病毒载体 32
关于“生物化学与分子生物学/噬菌体载体”的留言: Feed-icon.png 订阅讨论RSS

目前暂无留言

添加留言
个人工具
名字空间
动作
导航
推荐工具
功能菜单
工具箱