临床生物化学/方法建立时的条件选择

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在方法建立的原理确定后,尚需根据其原理来选择合适的条件,以保证所建的方法可靠。下面以亮度法为例介绍其条件选择的主要环节。颜色反应是亮度分析的基础,因此,用作亮度测定的颜色反应至少要具备以下几条:反应有较高的特异性,从而干扰小;反应产生的有色物质吸光系数要大,大者灵敏度高;有色产物的离解度要小,小则稳定;此外,还要求有色产物有恒定的组成成分,使产生的颜色稳定。由于影响颜色反应的因素很多,如温度、pH、试剂浓度、反应的时间等等。这些因素在建立新方法时都要逐项试验,确定最佳实验条件。

(一)选择合适的吸收光谱

实际上就是测定颜色反应产生的光吸收曲线。方法是在整个可见光区(400-700nm)以10nm(在接近最大吸收波长范围还应再细分)间隔。分为十几个点测定其在不同波长时的吸光度,然后以吸光度为纵坐标,波长为横坐标绘成光吸收曲线。在条件许可的情况下,应采用双光束分光光度计在可见光区进行波长扫描,结果较为可靠。同时,还应以同法分别测定其空白液和标准物颜色产物的吸收曲线。测定光吸收曲线的目的是找出最大吸收波长,作为光度法波长选择的依据。因为在最大吸收波长测定,可获得最大灵敏度,且能更符合比耳定律。然而在实际使用中,不能单纯考虑灵敏度高,还要考虑在测定浓度范围能否符合比耳定律,并能在光度计准确区域内(吸光度0.2-0.85之间)读出读数。有时由于测定的最大吸收波长并不是所要测定物质的特性吸收波长,即同时存在具有相似最大吸收的干扰物质,为了保证实验的特异性,常改用特有而非最大吸收波长进行测定。例如用磷钼酸测定血糖,选用波长420nm,溶液对此波长的吸收比其它波长光线的吸收都低,其目的是使参考值有一个较低的吸收,这样可允许在相同情况下对高出参考值的血糖也能得到准确的读数。因为在这项测定中,高血糖是常见的变化方向。

(二)测定方法适用的浓度范围

根据光吸收定律,溶液的吸光度应与溶液的浓度成正比。但由于有色物质的电离、水解、缔合等原因当溶液稀释或增浓时,有色物质颜色的深浅并不按比例降低或增高,因而也就不符合光吸收定律。测定方法适用的浓度范围是指分析的浓度范围在直线线性段,浓度与吸光度之比为一常数,此时直线上任何一点的斜率tanθ相等,即:

tanθ=A1/C1=A2/C2=A3/C3=……=An/Cn=K

此处K即为校正常数,可用于结果计算。

通常稀溶液都是符合比耳定律的,但在浓度过高和过低时往往都不呈直线,说明低浓度部分亦有仪器的灵敏度和方法的检测能力限制,所以,具体的测定就宜选择在直线段浓度范围内进行。以此还可用于确定标本的用量,使具有临床意义的标本测定结果都落在直线范围内。

(三)观察影响颜色反应的因素

影响颜色反应的主要因素有:溶液pH的影响、杂质的影响、反应的温度和时间、以及颜色的稳定性等。这些都是光度法测定误差的主要来源。都需要通过实验来观察并控制在一个适宜的范围内。从而保证方法的准确性和精密性。

⒈溶液pH的影响有些溶液的颜色对pH值的改变非常灵敏。例如白蛋白在pH4左右可与溴甲酚绿结合后由黄色变成绿色,绿色的深浅与白蛋白浓度成正比,但是溴甲酚绿本身是一种pH指示剂,当pH5.4时即由黄色转变成绿色,在pH3.8时又由绿色变为黄色。在白蛋白与溴甲酚绿结合颜色反应中,如pH控制不好就很容易出现误差,又如每种酶都有各自的最适pH,酶促反应中,只有在其最适pH时才能发挥充分的催化活性。因此,在建立方法时可在不同pH值条件下(其它条件不变)令其反应,以观察颜色反应的吸光度变化,从而选择合适的pH值范围来保证颜色反应,以求较高的灵敏度和较好的线性。有时还需用相应的pH缓冲液来维持反应的pH,以利颜色反应的正常进行。

⒉杂质的影响由于临床生化标本中除含待测物质外,还含有许多非测定物质,成分十分复杂,它们有的可与有色产物作用,使产生的颜色逐渐退去,有的与待测物质相类似,也能缓慢地与显色试剂生成有色化合物或沉淀,有的本身是有色的等,都会影响被测物溶液的颜色。试验方法是将各种可疑物质的纯溶液作标本单独进行测定,如产生颜色反应,这说明该方法的特异性不高。如果将待测物质混入可疑物质作标本测定,改变了被测物质与试剂间的反应,这是干扰(具体方法见第三节)。为此就需要进一步改进方法,或设立标本空白,或将标本作适当处理,除去干扰物,或加入合适的干扰物掩蔽剂等,以提高方法的特异性。

⒊反应的温度和时间有些有色物质能迅速反应生成,另一些有色物质须经过相当长时间后反应才能完全。提高反应的温度可以加速化学反应,缩短反应的时间。因此,如果在不恰当的温度和时间内进行比色,将会造成相当大的误差。这可以在不同的温度下(如设定25℃,30℃,37℃)令其反应,通过检测吸光度来观察各自反应终点时间(一般达到反应终点,随后测定的吸光度不再变化),以选定适宜临床应用的反应最佳温度和时间。

⒋稳定性试验待测物质经显色反应产生的有色物稳定与否,关系到测定结果的可靠性。某些有色物质虽然生成很快,但却不太稳定,放置后色泽会逐步消退或起变化,有些干扰物虽不能与被测物质同时发生颜色反应,但当放置一段时间后也能缓慢地与试剂显色,使溶液颜色加深。因此,在方法建立的同时作稳定性试验很有必要。试验的方法是用被测标本、标准溶液、空白溶液按方法要求进行显色反应后,即刻及室温放置不同时间,分别测定其吸光度,根据其吸光度的变化确定方法稳定的时间范围。一般要求有色溶液能稳定二小时以上就能满足临床应用的需要。必要时还要加以注明。

32 方法建立的原理确定 | 方法建立后的临床观察 32
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