临床生物化学/主要实验参数的选择(设置)

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一般自动分析仪有12个主要数据,即波长、温度、标本试剂量、空白时间(Tb)、开始收集实验数据时间(Ti)、实验数据收集窗时间(TW)、实验数据收集完成时间(Td)和最后时间(Tf)、速率时间(Tr)、线性限度(L)、异常吸收率(ABN)、曲线拟合、浓度因素(F)。这些参数都是通过方法学的研究之后,根据反应的具体情况加以确定的。

(一)波长

根据分光亮度计的光吸收曲线或者一个比色杯不同波长的反应曲线选择分析波长和空白波长。对快速反应,以光吸收曲线的低凹区波长为空白波长,光吸收曲线中吸亮度最大而较平坦区的波长为分析波长。

(二)温度

一般均选用30℃。

(三)样品量及试剂量

可根据手工法按比例缩减或者重新设计。要考虑到检测灵敏度、线性范围,尽可能将样品稀释倍数大些,以降低样品中其它成分的影响。

(四)分析时间的确定

用高、中、低浓度的标准液进行实验用研究模式,进行酶促反应时间曲线或反应速度时间曲线的观察,根据吸收率动态变化的具体数据,确定有关的分析时间。

⒈Tb 终点法,吸光度上升型,一般选择反应尚示开始而试剂和样品已充分混合均匀,一般定为4秒。动态法的Tb=Ti。

⒉Ti 终点法选择反应接近平衡期,动态法则选择接近进入线性期。这个参数不很严格。如果Ti定的太早,过多的不符合要求的数据点将舍弃。Ti定的太晚,数据收集时间就要延长,在动态法还可能使底物耗尽的发生机会增多。在终点法Ti大致定于Tf的70%或接近于反应完全时,动态法确定Ti时,主要考虑避开酶反应的延迟期以及试剂和样品混合后温度不平衡期。

⒊TW 根据高、中、低浓度标准液反应速度时间曲线加以确定。要求各标准液的吸光度变化在该时间内均在线性判断标准范围内。终点法一般为4-10秒。在动态法中,为了使反应不出现未反应(NR)的标志,在Tb与Tf之间至少有8mA的吸收率变化。在快速反应时,TW从30秒开始,按10秒向上递增。在慢反应可达120秒。TW不应太长,否则可以偏离线性,也减低工作效率。

⒋Tr Tr值的大小对方法的精密度有较显著的影响。为了保证方法的精密度,使△A>1.0mA是必要的。如Tr时间短,△A太小,测定方法的精密度就降低。一般情况下,Tr定为20-60秒。在现有程序中,是以正常低值标本的△A>1mA来决定Tr值。如ALT测定,正常低值为7u/L,Tr=7u/L/2.57=2.7mA/60秒,30秒=1.35mA,故选30秒为Tr时间。

(五)线性判断标准(线性限L)

指在数据收集窗时间内吸收率变化的允许范围。作为终点法,从理论上讲,化学反应达到平衡(终点),吸光度应该稳定不变,也就是说,在TW内吸收率变化应该是零,即线性判断标准应该定为零。在实际中,由于信号有一定的飘移,更主要是测定要求快速,是在反应还没真正到达终点时进行测定,加上自动分析仪检测的灵敏度大多较高,精度可达到0.1mA,所以在TW期间的吸收率会有一定的波动。不同的化学反应或酶促反应,吸光度变化程度不一。要根据实验结果选择一个适当的吸光度变化范围作为线性判断标准,以此来判定反应是否达到了平衡。这个标准值如果定的太小,反应也很难达到要求的标准,出现非线性的机会太多,或者要延长观测时间,降低工作效率,这就不符合快速分析的要求。相反,这个线性判断标准定的太大,就失去了判断线性的意义,出现反应根本没有达到终点就错误地判为达到标准,影响测定结果的可靠性。在终点法中,L单位是mA/2秒,大多选用1.0mA/2秒。如出现反应不完全,可按0.5mA顺序增加。在动态法中,L单位是mA/秒,一般从0.1mA/秒开始,如果试验结果出现非线性(NL)情况多,可以增大,按0.01mA递增,但不可超过0.1mA。

(六)异常吸收率限度

这一参数主要根据每个法实验测定的线性范围来确定。即用吸光率作为纵轴,标准液浓度为横轴,绘制标准曲线。这个线性段向非线性段转折拐点的相应吸收率值即为异常吸收率限度。终点法吸收率超过此值被标志为超出限度(XL)。在动态法中,试剂空白的吸收率超过ABN,ABN被标志为试剂吸收率异常(AB),测定杯的吸收率超过ABN时,ABN被标志为底物耗尽(EX)。

32 分析方法的分类 | 仪器室条件及仪器操作 32
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