限制酶

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限制酶(Restriction Enzymes)全称限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解;而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。

细菌反击

细菌容易被噬菌体感染,如已经在每月推荐分子中看到的phix174噬菌体。许多细菌用切割外来DNA的方法进行自我保护,如切割感染性噬菌体的DNA。这些细菌产生一种能切割DNA的核酸内切酶,一旦发现外来DNA便将其切割,因此它们有效地限制了噬菌体对细菌的感染,故这种核酸内切酶被称为限制酶。

分子剪刀

每种限制酶特异识别专一DNA序列,并在切割位点将其准确切割。例如,EcoR1切割GAATTC序列,切割位点在G与A之间。细菌将自身的DNA甲基化修饰,防止了被自身核酸内切酶降解。这些甲基化基团被装到DNA大沟的腺嘌呤胞嘧啶上(依细菌种类而定),使限制酶不能与DNA序列结合,但又不影响这些DNA序列上遗传信息的正常识别与表达。噬菌体DNA没有这些保护性的甲基化基团,所以会被降解。每种细菌都有一种或几种用来切割特异DNA序列的限制酶,还有与限制酶配对的甲基转移酶,用来防止限制酶降解细菌基因中的相应序列。

目录

限制酶的分布

限制性核酸内切酶分布极广,几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶,多者在一属中就有几十种,例如在嗜血杆菌属中(Haemophilus)现已发现的就有22种。有的菌株含酶量极低,很难分离定性;然而在有的菌株中,酶含量极高.如E. coli的pMB4(EcoRI酶)和H. aegyptius(Hal III酶)就是高产酶菌株。据报道从10g的H. aegyptius的细胞中,能分离提纯出可消化l0gλ噬茵体DNA的酶量。到目前为止,细菌是限制性内切酶,尤其是特异性非常强的I类限制性内切酶的主要来源。  

 限制性内切酶的分类和性质

根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子,限制性内切酶可分为两大类,即I类酶和II酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。其分子量较大;反应过程中除需Mg2+外,还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP;在DNA分子上没有特异性的酶解片断,这是I、II类酶之间最明显的差异。因此,I类酶作为DNA的分析工具价值不大。II类酶有EcoR I、BamH I、Hind II、Hind III等。其分子量小于105道尔顿;反应只需Mg2+;最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点,因而DNA分子经过II类酶作用后,可产生特异性的酶解片断,这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。

限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧(如EcoR I、BamH I、Hind等),因而可形成粘性末端,另一些II类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal III、HPa I、Sma I等,切割位点在回文序列中间,形成平整末端。Alu I的切割位点如下:

5'-A G^C T-3'

3'-T C^G A-5'

在已发现的限制性内切酶中,近百种酶的识别顺序已被测定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序,这种酶称为“异源同功酶”(isochizomer,同切限制内切酶;同裂酶)。应该注意的是,这些酶虽然有相同的识别顺序,但它们的切点并不完全一样。例如Xma I和Sma I都识别六核苷酸CCCGGG,但Xma I的切点在cCCGGG,而Ema I的切点则在CCCGgGG,前者切割DNA分子,形成带有CCGG粘性末端的DNA片段,而后者并不形成粘性末端。当然,也有识别顺序和切点都相同的酶,如Hap II、Hpa II、Mno I,都在识别顺序CCGG内有一相同的切点,Hal III和BsuR I同样在识别顺序GGCC内有一相同的切点。  

用途

用于DNA基因组物理图谱的组建;基因的定位和基因分离;DNA分子碱基序列分析;比较相关的DNA分子和遗传工程。  

命名

限制酶的命名是根据细菌种类而定,以EcoRI为例:

E Escherichia (属)
co coli (种)
R RY13 (品系)
I 首先发现 在此类细菌中发现的顺序

  

类型

根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型,分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。  

第一型限制酶

同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用;另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力,通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。  

第二型限制酶

只具有认知切割的作用,修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上,实用性较高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindIII。  

第三型限制酶

与第一型限制酶类似,同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列,切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如:EcoPI、HinfIII。

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