血蓝蛋白

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hemocyanin;haemocyanin

又称血清

它是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)地血淋巴中发现地一种游离的蓝色呼吸色素血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的离子,与含血红蛋白类似,它易于结合,也易与氧解离,是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白,氧化时呈青绿色,还原时呈白色。其分子量450 000~130 000。节肢动物的血蓝蛋白一条多肽链与一分子氧结合,含铜量0.17%;软体动物的血蓝蛋白一条多肽链则与6分子氧结合,含铜量0.025%。铜以二价形式与蛋白直接结合。血蓝蛋白有多种催化作用,特别是变性后,在特定条件下具有多酚氧化酶过氧化氢酶和脂氧化酶等活性。

在一些无脊椎动物中,多数动物的血液不含血红蛋白,如软体动物(头足动物和石鳖属等)以及节肢动物(虾、蟹及肢口纲的鲎)所含的是血蓝蛋白(亦称为血蓝素)。血蓝蛋白分子由Cu2+和1个约200个以上氨基酸链结合而成,和血红蛋白一样,该呼吸色素的颜色也与其状态有关,在氧和状态下为蓝色,在非氧和状态下则为无色或白色。

关键词:载氧功能;抗病毒活性;抗菌活性;凝血功能

血蓝蛋白是节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白,脱氧状态为无色,结合氧状态为蓝色。分子质量一般为50 ku~75 ku,由7个或8个功能单位组成圆柱形结构。组成血蓝蛋白的亚单位数目较多,每个亚单位都含有2个Cu(Ⅰ)离子。不同蛋白质所含亚单位数目不同,有些血蓝蛋白的分子质量可达9×103 ku。软体血蓝蛋白是圆柱状分子,含有10个~20个亚单位,每个亚单位(分子质量为350 ku~450 ku)有7个~8个功能单元(氧分子结合部位)。节肢动物血蓝蛋白由六聚体或多个六聚体组成,分子质量约为3.5×103 ku,每个亚单位(分子质量为7.5 ku)含有一个氧合中心。血蓝蛋白的主要生物学功能与机体内的输氧有关,它与血红蛋白(hemoglobins)和蚯蚓血红蛋白(hemerythreins)并称为动物界中的3种呼吸蛋白。但近年的研究表明,血蓝蛋白是一种多功能蛋白,它不仅具有输氧功能,而且还与能量的贮存、渗透压的维持及蜕皮过程的调节有关。特别引起学术界重视的是,血蓝蛋白还具有酚氧化物酶活性和抗菌功能,被认为是节肢动物和软体动物中的一种重要的免疫分子。

1 血蓝蛋白的结构特点

血蓝蛋白是虾血淋巴中的含铜呼吸蛋白,每个氧结合位点有2个铜原子,其氧的结合位点与另一种铜离子结合蛋白——酚氧化酶的氧结合位点的结构具有很高的相似性。血蓝蛋白在脱氧状态为无色,结合氧为蓝色。

柱结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及电镜技术,研究中国鲎鱼血蓝蛋白(hemocyanin)的结构特点,结果表明经Sephadex G­100纯化的血蓝蛋白在PAGE电泳中出现4个条带],纯化的血蓝蛋白再经DEAE­32层析得到5个洗脱峰,每个峰在PAGE电泳下可分辨出4个条带,电镜下,血蓝蛋白分子出现环形、五角形、十字形和蝴蝶结形等构型并与其他解离的中间的构型同时存在。

节肢动物门的螯肢类、甲壳类、多足类和蜘蛛中都含有血蓝蛋白,其中最大的类群昆虫虽不存在血蓝蛋白,但含有与血蓝蛋白有同源关系的六聚蛋白(hexamer)。六聚蛋白又分为富含芳香族氨基酸的和富含甲硫氨基酸的两个类群。在节肢动物的近亲有爪类(Onychophora)中也发现了节肢动物类型的血蓝蛋白。节肢动物类型的血蓝蛋白有四级结构三级结构。血蓝蛋白的三级结构,分子质量约为75 ku,其中第2个域为α螺旋区,螯合1对Cu+,可结合1个O2,下方为第3个域,由β折叠块构成并含有Ca离子,功能尚不详。

节肢动物血蓝蛋白至少已分化成为:①酚氧化酶原(prophenoloxidase);②昆虫的六聚蛋白(hexamer),不螯合Cu+,为贮藏蛋白;③甲壳类的假血蓝蛋白(pseudohemocyanin或cryptocyanin),也为贮藏蛋白;④双翅类的六聚蛋白受体。经分子系统学的分析,它们与血蓝蛋白相聚,共同构建了节肢动物血蓝蛋白基因超家族

2 血蓝蛋白的功能

血蓝蛋白的载氧功能

血蓝蛋白是以一价铜离子作为辅基的蛋白质。它存在于软体动物(如章鱼、乌贼、蜗牛等)和节足动物(如螃蟹、虾、蜘蛛等)的血液里。血蓝蛋白的生理功能是输氧。氧合血蓝蛋白的铜是Cu(Ⅱ)并呈蓝色,在347 nm附近有吸收峰,这是由扭曲四面体场中的d­d跃进产生的。脱氧血蓝蛋白呈无色。X射线衍射技术大大增加了人们对血蓝蛋白的认识。虽然目前仍未测出软体血蓝蛋白的晶体结构,但为节肢动物血蓝蛋白的晶体结构分析提供了血蓝蛋白分子活性部位的结构信息。龙虾血蓝蛋白亚单位由3个结构区域组成。区域Ⅰ为蛋白的前175个氨基酸残基组,有大量的α螺旋二级结构;区域Ⅱ大部分也为α螺旋二级结构,由225个氨基酸残基(176个~400个)和作氧分子键合部位的双铜离子组成;剩余的258个氨基酸残基(401个~658个)构成区域Ⅲ,并且类似于如超氧化物歧化酶等其他蛋白的β折叠二级结构。在区域Ⅱ的双铜活性中心中,每个铜离子与3个组氨酸残基咪唑氮配位。未氧合时,2个铜离子相距约46 pm,相互作用很弱,没有发现2个铜离子之间存在着蛋白质本身提供的桥基。此时,每个铜离子与3个组氨酸残基咪唑氮的配位基本上是三角形几何构型。氧合后,Cu(Ⅱ)为四配位或五配位,两个铜离子与两个氧原子(过氧阴离子)和6个组氨酸残基中最靠近铜离子的4个组氨基酸残基咪唑氮强配位。此时,在一个近似的平面上,每个铜离子呈平面正方形几何构型,这是Cu(Ⅱ)最有利的配位状况。氧分子以过氧桥形式在连接两个Cu(Ⅱ),两个Cu(Ⅱ)相距约36 pm。

化学家对合成血蓝蛋白的模型化合物颇感兴趣。1978年Simmons M G和Wilson L J合成了以咪唑作为配体的Cu(Ⅰ)配合物,在室温下无论是溶液或固体都能可逆载氧。用2,6­二乙酰基吡啶组胺缩合,得到配体2,6­[1­(2­咪唑­4­亚乙基亚氨基)乙基]吡啶,然后在氮气保护下加入[Cu(Ⅰ)(MeCN)4](ClO4)得到暗红色的[Cu(Ⅰ)](ClO4)配合物。

该配合物在溶液中以单体形式存在。Cu(Ⅰ)离子的配位数为5。在室温下露置于空气中,溶液迅速从红色变为绿色,约2 min后反应完全,每2 mol Cu(Ⅰ)吸收1 mol O2。如果把载氧后的溶液温热至40 ℃左右并用氮气赶跑气体,或在减压下搅拌溶液,很容易发生放氧逆反应,溶液恢复原来的红色。如此重复实验证实它能可逆载氧。据此推测可能存在下列反应LCuⅠ + O2LCuⅡO   LCuⅡO + CuILLCuⅡO CuⅡL

血蓝蛋白的抗病毒作用

血蓝蛋白具有非特异性抗病毒作用。应用亲和层析从斑节对虾(Penaeus monodon)血清中分离出2种能与白斑杆状病毒(White spot syndrome virus ,WSSV)和虹彩病毒(Singapore grouper irido virus,SGIV)结合的多肽,分子质量分别为73 ku和75 ku,经质谱分析鉴定为血蓝蛋白,将血蓝蛋白和病毒混合后添加到细胞培养液,培养3 d后发现细胞只受到较轻微的破损。而不含血蓝蛋白的对照组细胞则完全裂解。如果延长培养时间,试验组细胞也相继裂解。随后选用6种DNA 或RNA病毒(SGIV、FV3、LDV、ThRV、ABV和IPNV)进行分析,结果发现其半抑制浓度(Semi­inhibitory concentration,ECs)约为4.56 mg/L~6.64 mg/L。这些结果表明,血蓝蛋白在低浓度时是潜在的病毒抑制物,但血蓝蛋白不能完全抑制病毒的复制。

研究发现血蓝蛋白的两个亚基免疫功能上有很大差异,Lei K Y等报道,血蓝蛋白的两个分子质量73 ku和75 ku的亚基,只有75 ku的PjHcL亚基具有抗病毒功能,PjHcY亚基不具有抗病毒功能,它意味着这两个血亚基可能起不同的角色。从序列和结构的比较发现,尽管这两个亚基是高度保守的,它们表现出一定的差异在N端域和C端域。比对两个亚基的氨基酸结构发现,在铜离子结合位点及第2功能区两个亚基结构完全相同,只有在第3功能区PjHcL亚基和PjHcY亚基的氨基酸α、β构型不同。Lei等采用RT­PCR技术精确验证了这一结果,并且发现了两个亚基的不同免疫功能,为以后研究血蓝蛋白的免疫学功能提供了更明确的依据。

总之,血蓝蛋白的免疫防御功能是近年来无脊椎动物免疫学领域的最新发现,在免疫反应中,仅可表现出酚氧化酶的功能,而且可裂解产生不同分子质量大小的抗菌片段以抵御病原的入侵。虽然其免疫机理目前尚不十分明确,但随着无脊椎动物上的演变相信其确实情况必将阐明。

血蓝蛋白的血凝作用

近年来国内外研究表明,血蓝蛋白及其裂解片段具有多种免疫功能。章跃陵以采自汕头的南美白对虾为研究对象,采用亲和层析、PAGE、SDS­PAGE、Western blot、血细胞凝集试验和糖抑制试验等方法探索南美白对虾血蓝蛋白的血细胞凝集活性。结果发现,血蓝蛋白对试验所选用的鱼、鸡、鼠和人等4种红细胞均具有显著的血细胞凝集活性,凝集活性大小为5 mg/L~10 mg/L,而且其凝集反应可被α­半乳糖、α­D葡萄糖甘露醇和N­乙酰神经氨酸等4种糖所显著抑制。不过,与一般的凝集素相比,血蓝蛋白的凝集活性大概低1个~2个数量级,它在虾血清中含量上的丰富也许可以弥补其凝集活性上的不足。既往研究中,发现血蓝蛋白蛋白斑点的肽质量谱峰值可以与流感病毒血凝素相匹配,其序列覆盖率为37%。由此推测,血蓝蛋白确实具有血细胞凝集活性,这对进一步研究血蓝蛋白的免疫学功能具有重要意义。

研究证实,血蓝蛋白可能由酚氧化酶进化而来,酚氧化酶级联系统的激活又与甲壳动物体内凝血蛋白的凝血机制紧密相关。研究发现血蓝蛋白也具有凝集活性。这些研究结果提示,血蓝蛋白、酚氧化酶及凝血蛋白可能是由同一蛋白进化而来,而血蓝蛋白这一多功能分子却保留了它们全部的免疫学功能。

血蓝蛋白的抗菌作用

血蓝蛋白裂解产生的抗微生物肽与对虾的免疫反应有关。近来又在大西洋白对虾和凡纳对虾的血淋巴中分离到3种带负电荷的抗真菌活性肽类,与血蓝蛋白C端序列的一致性达95%~100%。当对虾被感染后,血淋巴中这种血蓝蛋白C端序列的活性肽浓度升高,这表明血蓝蛋白的裂解是由生物学信号引起的。Lee S Y等从淡水螯虾血浆中得到一种由16个氨基组成的抗菌肽,能抑制G+和G-细菌的生长。这种抗菌肽是血蓝蛋白在酸性条件下经蛋白酶剪切产生。注射脂多糖葡聚糖可促进血蓝蛋白产生和释放这种肽。这说明抗微生物肽可以被诱导、释放和激活,从而在肌体的免疫防御中起作用。Zhang Y L等还在凡纳对虾血清中分离到一种能与羊抗人IgG特异性反应的IgG样蛋白,经检测为血蓝蛋白。研究发现,除铜结合位点外,在此血蓝蛋白的C端还存在一个由252个氨基酸组成的似Ig的保守区域。此外,还在血蓝蛋白和Ig的重链和k链分别发现4个和1个相似保守区域。很有可能这些相似Ig的保守区域赋予了甲壳动物呼吸色素新的功能,使其更好地发挥抗微生物作用。虽然到目前为止,血蓝蛋白的加工机制还不十分清楚,但它们在甲壳动物免疫系统中所起的作用不容忽视,因此进行深入细致的研究,搞清楚其免疫机制,对于甲壳类经济动物的疾病控制是至关重要的。

近年来,随着血蓝蛋白多种功能的不断发现,特别是免疫活性的发现,血蓝蛋白的功能、作用机理、进化地位已经引起各国学者的浓厚兴趣。进一步研究血蓝蛋白功能对于丰富和发展无脊椎动物,特别是甲壳类动物生理生化和免疫系统的基础研究,探索免疫这些结果表明,血蓝蛋白具有广谱抗细菌、真菌、病毒功能及独特的作用机理,有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源。我国是海洋大国,开发和利用海洋动物血蓝蛋白资源,将为研制抗菌新药提供理想分子设计骨架和模板,为发展新的抗感染药物奠定重要基础。此外,虾类血蓝蛋白的研究加深了人们对低等脊椎动物免疫防御机制的认识,为日益严重的虾类病害防治开辟了崭新的途径。同时,随着虾类转基因技术的发展,人们有可能通过转血蓝蛋白基因获得抗病新品种。可以相信,随着研究的不断深入,虾类血蓝蛋白将对世界水产渔业的可持续发展起到重要的作用。


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