光学显微镜

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      光学显微镜是利用光学原理,把人眼所不能分辨的微小物体放大成像,以供人们提取微细结构信息的光学仪器。  

目录

历史

早在公元前一世纪,人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时,可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。

1590年,荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后,意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时,改变物镜目镜之间的距离,得出合理的显微镜光路结构,当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。

17世纪中叶,英国的罗伯特.胡克和荷兰的列文.虎克,都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665年前后,胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进,成为现代显微镜的基本组成部分。

1673~1677年期间,列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜,其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜,在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。

19世纪,高质量消色差浸液物镜的出现,使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代,德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展,并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。

在显微镜本身结构发展的同时,显微观察技术也在不断创新:1850年出现了偏光显微术;1893年出现了干涉显微术;1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术,他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。

古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合,它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置,以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器,配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。

表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像,光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。近代的光学显微镜通常采用两级放大,分别由物镜和目镜完成。被观察物体位于物镜的前方,被物镜作第一级放大后成一倒立的实象,然后此实像再被目镜作第二级放大,成一虚象,人眼看到的就是虚像。而显微镜的总放大倍率就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积。放大倍率是指直线尺寸的放大比,而不是面积比。  

光学显微镜的组成结构

光学显微镜一般由载物台、聚光照明系统、物镜,目镜和调焦机构组成。载物台用于承放被观察的物体。利用调焦旋钮可以驱动调焦机构,使载物台作粗调和微调的升降运动,使被观察物体调焦清晰成象。它的上层可以在水平面内沿作精密移动和转动,一般都把被观察的部位调放到视场中

光学显微镜结构

心。

聚光照明系统由灯源和聚光镜构成,聚光镜的功能是使更多的光能集中到被观察的部位。照明灯的光谱特性必须与显微镜的接收器的工作波段相适应。

物镜位于被观察物体附近,是实现第一级放大的镜头。在物镜转换器上同时装着几个不同放大倍率的物镜,转动转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路,物镜的放大倍率通常为5~100倍。

物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件。常用的有能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜;质量更高的还有能对三种色光校正色差的复消色差物镜;能保证物镜的整个像面为平面,以提高视场边缘成像质量的平像场物镜。高倍物镜中多采用浸液物镜,即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体,它能显著的提高显微观察的分辨率。

目镜是位于人眼附近实现第二级放大的镜头,镜放大倍率通常为5~20倍。按照所能看到的视场大小,目镜可分为视场较小的普通目镜,和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。

载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦,获得清晰的图像。用高倍物镜工作时,容许的调焦范围往往小于微米,所以显微镜必须具备极为精密的微动调焦机构。

显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率,显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。

当选用的物镜数值孔径不够大,即分辨率不够高时,显微镜不能分清物体的微细结构,此时即使过度地增大放大倍率,得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像,称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足,则显微镜虽已具备分辨的能力,但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力,应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。

聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响,但又是易于被使用者忽视的环节。它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明。聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角,否则就不能充分利用物镜所能达到的最高分辨率。为此目的,在聚光镜中设有类似照相物镜中的 ,可以调节开孔大小的可变孔径光阑,用来调节照明光束孔径,以与物镜孔径角匹配。

改变照明方式,可以获得亮背景上的暗物点(称亮视场照明)或暗背景上的亮物点(称暗视场照明)等不同的观察方式,以便在不同情况下更好地发现和观察微细结构。  

光学显微镜的分类

光学显微镜有多种分类方法:按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜;按图像是否有立体

感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜;按观察对像可分为生物和金相显微镜等;按光学原理可分为偏光,相衬和微差干涉对比显微镜等;按光源类型可分为普通光、荧光、红外光和激光显微镜等;按接收器类型可分为目视、摄影和电视显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、紫外荧光显微镜等。

双目体视显微镜是利用双通道光路,为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置,两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角,以此形成三维空间的立体视觉图像。双目体视显微镜在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术;在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。

金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察,故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光,而后者以透射光照明。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面,被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。

紫外荧光显微镜是用紫外光激发荧光来进行观察的显微镜。某些标本在可见光中觉察不到结构细节,但经过染色处理,以紫外光照射时可因荧光作用而发射可见光,形成可见的图像。这类显微镜常用于生物学和医学中。

电视显微镜和电荷耦合器显微镜是以电视摄像靶或电荷耦合器作为接收元件的显微镜。在显微镜的实像面处装入电视摄像靶或电荷耦合器取代人眼作为接收器,通过这些光电器件把光学图像转换成电信号的图像,然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜的 可以与计算机联用,这便于实现检测和信息处理的自动化,多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。

扫描显微镜是成像光束能相对于物面作扫描运动的显微镜 。在扫描显微镜中依靠缩小视场来保证物镜达到最高的分辨率,同时用光学或机械扫描的方法,使成像光束相对于物面在较大视场范围内进行扫描,并用信息处理技术来获得合成的大面积图像信息。这类显微镜适用于需要高分辨率的大视场图像的观测。粗准焦螺旋:大范围上下调动镜筒。

细准焦螺旋:小范围上下调动镜筒。  

显微镜

显微镜是一种精密的光学仪器,已有300多年的发展史。自从有了显微镜,人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元——细胞。目前,不仅有能放大千余倍的光学显微镜,而且有放大几十万倍的电子显微镜,使我们对生物体的生命活动规律有了更进一步的认识。在普通中学生物教学大纲中规定的实验中,大部分要通过显微镜来完成,因此,显微镜性能的好坏是做好观察实验的关键。

一、显微镜的光学系统

显微镜的光学系统主要包括物镜、目镜、反光镜和聚光器四个部件。广义的说也包括照明光源、滤光器、盖玻片载玻片等。

(一)、物镜

物镜是决定显微镜性能的最重要部件,安装在物镜转换器上,接近被观察的物体,故叫做物镜或接物镜。

1、物镜的分类

物镜根据使用条件的不同可分为干燥物镜和浸液物镜;其中浸液物镜又可分为水浸物镜和油浸物镜(常用放大倍数为90—100倍)。

根据放大倍数的不同可分为 低倍物镜(10倍以下)、中倍物镜(20倍左右)高倍物镜(40—65倍)。

根据像差矫正情况,分为消色差物镜(常用,能矫正光谱中两种色光的色差的物镜)和复色差物镜(能矫正光谱中三种色光的色差的物镜,价格贵,使用少)。

2、物镜的主要参数:

物镜主要参数包括:放大倍数、数值孔径和工作距离。

①、放大倍数是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。例:放大倍数为100×,指的是长度是1μm的标本,放大后像的长度是100μm,要是以面积计算,则放大了10,000倍。

显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。

②、数值孔径也叫镜口率,简写NA 或A,是物镜和聚光器的主要参数,与显微镜的分辨力成正比。干燥物镜的数值孔径为0.05-0.95,油浸物镜(香柏油)的数值孔径为1.25。

③、工作距离是指当所观察的标本最清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离。物镜的工作距离与物镜的焦距有关,物镜的焦距越长,放大倍数越低,其工作距离越长。例:10倍物镜上标有10/0.25和160/0.17,其中10为物镜的放大倍数;0.25为数值孔径;160为镜筒长度(单位mm);0.17为盖玻片的标准厚度(单位 mm)。10倍物镜有效工作距离为6.5mm,40倍物镜有效工作距离为0.48mm 。

3、物镜的作用是将标本作第一次放大,它是决定显微镜性能的最重要的部件——分辨力的高低。

分辨力也叫分辨率或分辨本领。分辨力的大小是用分辨距离(所能分辨开的两个物点间的最小距离)的数值来表示的。在明视距离(25cm)之处,正常人眼所能看清相距0.073mm的两个物点,这个0.073mm的数值,即为正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨距离越小,即表示它的分辨力越高,也就是表示它的性能越好。

显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的,而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。

当用普通的中央照明法(使光线均匀地透过标本的明视照明法)时,显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA

式中d——物镜的分辨距离,单位 nm。

λ——照明光线波长,单位 nm。

NA ——物镜的数值孔径

例如油浸物镜的数值孔径为1.25,可见光波长范围为400—700nm ,取其平均波长550 nm,则d=270 nm,约等于照明光线波长一半。一般地,用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm。

(二)、目镜

因为它靠近观察者的眼睛,因此也叫接目镜。安装在镜筒的上端。

1、目镜的结构

通常目镜由上下两组透镜组成,上面的透镜叫做接目透镜,下面的透镜叫做会聚透镜或场镜。上下透镜之间或场镜下面装有一个光阑(它的大小决定了视场的大小),因为标本正好在光阑面上成像,可在这个光阑上粘一小段毛发作为指针,用来指示某个特点的目标。也可在其上面放置目镜测微尺,用来测量所观察标本的大小。

目镜的长度越短,放大倍数越大(因目镜的放大倍数与目镜的焦距成反比)。

2、目镜的作用

是将已被物镜放大的,分辨清晰的实像进一步放大,达到人眼能容易分辨清楚的程度。

常用目镜的放大倍数为5-16倍。

3、目镜与物镜的关系

物镜已经分辨清楚的细微结构,假如没有经过目镜的再放大,达不到人眼所能分辨的大小,那就看不清楚;但物镜所不能分辨的细微结构,虽然经过高倍目镜的再放大,也还是看不清楚,所以目镜只能起放大作用,不会提高显微镜的分辨率。有时虽然物镜能分辨开两个靠得很近的物点,但由于这两个物点的像的距离小于眼睛的分辨距离,还是无法看清。所以,目镜和物镜即相互联系,又彼此制约。

(三)、聚光器

聚光器也叫集光器。位于标本下方的聚光器支架上。它主要由聚光镜和可变光阑组成。其中,聚光镜可分为明视场聚光镜(普通显微镜配置)和暗视场聚光镜。

1、光镜的主要参数

数值孔径(NA )是聚光镜的主要参数,最大数值孔径一般是1.2—1.4,数值孔径有一定的可变范围,通常刻在上方透镜边框上的数字是代表最大的数值孔径,通过调节下部可变光阑的开放程度,可得到此数字以下的各种不同的数值孔径,以适应不同物镜的需要。有的聚光镜由几组透镜组成,最上面的一组透镜可以卸掉或移出光路,使聚光镜的数值孔径变小,以适应低倍物镜观察时的照明。

2、聚光镜的作用

聚光镜的作用相当于凸透镜,起会聚光线的作用,以增强标本的照明。一般地把聚光镜的聚光焦点设计在它上端透镜平面上方约1.25mm处。(聚光焦点正在所要观察的标本上,载玻片的厚度为1.1mm左右)

3、可变光阑

可变光阑也叫光圈,位于聚光镜的下方,由十几张金属薄片组成,中心部分形成圆孔。其作用是调节光强度和使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相适应。可变光阑开得越大,数值孔径越大(观察完毕后,应将光圈调至最大)。

在可变光阑下面,还有一个圆形的滤光片托架。

说明:在中学实验室只有教师用显微镜(1600×或1500×)才配有聚光器,学生用显微镜(640×或500×)配的是旋转光栏。紧贴在载物台下,能做圆周转动的圆盘,旋转光栏(也称为遮光器),光栏上有大小不等的圆孔,叫光圈。直径分别为2、3、6、12、16mm,转动旋转光栏,光栏上每个光圈都可以对正通光孔,通过大小不等的光圈来调节光线的强弱。

(四)反光镜

反光镜是一个可以随意转动的双面镜,直径为50mm,一面为平面,一面为凹面,其作用是将从任何方向射来的光线经通光孔反射上来。平面镜反射光线的能力较弱,是在光线较强时使用,凹面镜反射光线的能力较强,是在光线较弱时使用。

反光镜通常一面是平面镜,另一面是凹面镜,装在聚光器下面,可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。

反光镜的作用是使由光源发出的光线或天然光射向聚光器。当用聚光器时一般用平面镜,不用时用凹面镜;当光线强时用平面镜,弱时用凹面镜。

观察完毕后,应将反光镜垂直放置。

(五)照明光源

显微镜的照明可以用天然光源或人工光源

1、天然光源

光线来自天空,最好是由白云反射来的。不可利用直接照来的太阳光。

2、人工光源

①、对人工光源的基本要求:有足够的发光强度;光源发热不能过多。

②、常用的人工光源:显微镜灯;日光灯

(六)滤光器

安装在光源和聚光器之间。作用是让所选择的某一波段的光线通过,而吸收掉其他的光线,即为了改变光线的光谱成分或削弱光的强度。分为两大类:滤光片和液体滤光器。

(七)盖玻片和载玻片

盖玻片和载玻片的表面应相当平坦,无气泡,无划痕。最好选用无色,透明度好的,使用前应洗净。

盖玻片的标准厚度是0.17±0.02mm,如不用盖玻片或盖玻片厚度不合适,都回影响成像质量。

载玻片的标准厚度是1.1±0.04mm,一般可用范围是1—1.2mm,若太厚会影响聚光器效能,太薄则容易破裂。

二、显微镜的机械装置

显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分。其作用是固定与调节光学镜头,固定与移动标本等。主要有镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、与调焦装置组成。

(一)、镜座和镜臂

1、镜座 作用是支撑整个显微镜,装有反光镜,有的还装有照明光源。

2、镜臂 作用是支撑镜筒和载物台。分固定、可倾斜两种。

(二)、载物台(又称工作台、镜台)

载物台作用是安放载玻片,形状有圆形和方形两种,其中方形的面积为120mm×110mm。中心有一个通光孔,通光孔后方左右两侧各有一个安装压片夹用的小孔。分为固定式与移动式两种。有的载物台的纵横坐标上都装有游标尺,一般读数为0.1mm,游标尺可用来测定标本的大小,也可用来对被检部分做标记。

(三)、镜筒

镜筒上端放置目镜,下端连接物镜转换器。分为固定式和可调节式两种。机械筒长(从目镜管上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离称为镜筒长度或机械筒长)不能变更的叫做固定式镜筒,能变更的叫做调节式镜筒,新式显微镜大多采用固定式镜筒,国产显微镜也大多采用固定式镜筒,国产显微镜的机械筒长通常是160mm。

安装目镜的镜筒,有单筒和双筒两种。单筒又可分为直立式和倾斜式两种,双筒则都是倾斜式的。其中双筒显微镜,两眼可同时观察以减轻眼睛的疲劳。双筒之间的距离可以调节,而且其中有一个目镜有屈光度调节(即视力调节)装置,便于两眼视力不同的观察者使用。

(四)、物镜转换器

物镜转换器固定在镜筒下端,有3-4个物镜螺旋口,物镜应按放大倍数高低顺序排列。旋转物镜转换器时,应用手指捏住旋转碟旋转,不要用手指推动物镜,因时间长容易使光轴歪斜,使成像质量边坏。

(五)、调焦装置

显微镜上装有粗准焦螺旋和细准焦螺旋。有的显微镜粗准焦螺旋与装在同一轴上,大螺旋为粗准焦螺旋,小螺旋为细准焦螺旋;有的则分开安置,位于镜臂的上端较大的一对螺旋为是粗准焦螺旋,其转动一周,镜筒上升或下降10mm。 位于粗准焦螺旋下方较小的一对螺旋为细准焦螺旋,其转动一周,镜筒升降值为0.1mm,细准焦螺旋调焦范围不小于1.8mm。

三、显微镜及其部件的使用

1、使用单筒显微镜时,要养成用左眼观察的习惯(因一般用右手画图),观察时要两眼同时睁开,不要睁一只闭一只,因为这样易于疲劳。为了训练学生习惯于两眼同时睁开观察,可剪一块长约14cm,宽约6cm的长方形硬纸片,在靠近左端处挖一个直径比镜筒上端外径略小的圆孔,把圆孔套在镜筒上段,观察时两眼同时睁开,利用纸片的右端挡住右眼的视线,这样训练一段时间后,就能习惯于两眼同时睁开,然后把纸片去掉。

2、直筒显微镜的镜臂与镜座连接处,是一个机械关节,可用于调节镜筒的倾斜度,便于观察,镜臂不能过于后倾,一般不超过40°。但是在使用临时装片观察时,禁止使用倾斜关节(当镜筒倾斜时,载物台也随之倾斜,载玻片上的液体易流出),尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用,以免污损镜体。

3、目镜和物镜的使用

一般都是用一个放大倍数适中的目镜(10×)和最低倍的物镜开始观察,逐步改用倍数较高的物镜,从中找到符合实验要求的放大倍数。

转换物镜时,先用低倍镜观察,调节到正确的工作距离(成像最清晰)。如果进一步使用高倍物镜观察,应在转换高倍物镜之前,把物像中需要放大观察的部分移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,视野中的物像范围缩小了很多)。低倍物镜和高倍物镜基本齐焦(同高调焦),在用低倍物镜观察清晰时,换高倍物镜应可以见到物像,但物像不一定很清晰,可以转动细准焦螺旋进行调节。

通常认为,使用任何一个物镜时,有效放大倍数的上限是1,000乘它的数值孔径,下限是250乘它的数值孔径。如40×物镜的数值孔径是0.65,则上、下限分别为:1000×0.65=650倍和250×0.65≈163倍,超过有效放大倍数上限的叫做无效放大,不能提高观察效果。低于下限的放大倍数则人眼无法分辨,不利于观察。一般最实用的放大倍数范围是500—700乘数值孔径之间的数字。

4、油浸物镜的使用

使用油浸物镜时,一般不要使用同高调焦。同高调焦只适用于每台显微镜的原配物镜,在使用低倍和高倍物镜时,是一个极有利的方便条件,但在使用油浸物镜时,则受到一定限制,一般地说,用油镜观察未加盖玻片的标本片(载玻片)时,利用同高调焦的安全度较大,而对于有盖玻片的标本片,要小心使用,因为油浸物镜的工作距离很短,在设计和装配时所考虑的同高是对标准厚度盖玻片的。

用油浸物镜时,只在标本片上滴香柏油。观察完毕后,要及时进行清洁工作,如不及时进行,香柏油粘上灰尘,擦拭时灰尘粒子可能磨损透镜,香柏油在空气中暴露时间长,还会变稠、变干,擦拭很困难,对仪器很不利。擦拭要细心,动作要轻。油浸物镜前端先用干的擦镜纸擦一两次,把大部分油去掉,再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦两次,最后再用干的擦镜纸擦一次。标本片上的香柏油可用“拉纸法”(即把一小张擦镜纸盖在香柏油上,然后在纸上滴一些二甲苯,趁湿把纸往外拉,这样连续三四次,即可干净,一般不会损坏未加盖玻片的涂片标本)擦净。擦镜纸也要防尘,一般在使用前,将每页剪成8小块,贮存在一个干净的小培养皿中,用起来既节省又方便。

5、聚光器的使用方法

①、使用聚光器的原因

当放大倍数增加时,一方面由于放大倍数越高,透镜数目越多,被透镜吸收的光线也越多;另一方面由于视场(指的是所能看到被检标本的范围)的亮度与放大倍数的平方成反比,即放大倍数越高,视场越暗。为了得到足够的亮度,必须安装聚光器,把光线集中到所要观察的标本上。

②、观察时聚光器应处的高度

观察时,要保证得到最好的观察效果,聚光器的聚光焦点应正好落在标本上。要实现这个条件,就必须调节聚光器的高度。当用平行光照明时,聚光器的聚光焦点是在它上端透镜平面中心上方约1.25mm之处,因此,人们常常要求在观察时将聚光器上升到它上端透镜平面仅稍稍低于载物台平面的高度,这样聚光焦点就可能落到位于标准厚度载玻片上的标本上。当使用比标准厚度薄的载玻片来承放标本时,聚光器的位置要相应地降低一些,而当使用过厚地载玻片时,聚光焦点只能落在标本下方,不利于精细的观察。

③、聚光器与物镜的配合

这里所谓的配合,就是使聚光器和物镜这两者的数值孔径取得一致,以更好的进行较为精细的观察。假如聚光器的数值孔径低于物镜,那物镜的部分数值孔径就浪费了,从而达不到它的最高分辨力。假如把聚光器的数值孔径大于物镜的数值孔径,则一方面不能提高物镜的规定分辨力,另一方面反会由于照明光束过宽,使物象的清晰度下降。聚光器与物镜配合的操作方法是:在完成照明、调焦操作后,取下目镜直接向镜筒中看,把聚光器下的可变光阑关到最小,再慢慢地开大。开到它的口径与所见视场的直径恰好一样大,然后按上目镜,即可进行观察。每转换一次物镜,都要随着进行依次这样的配合操作。有的聚光器可变光阑的边框上刻有表示开启口径的尺度,可以根据刻度来进行配合。

历史上显微镜的发明和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的发展;给人类的生活带来了空前的拓展。在提倡科技创新的今天,显微镜的使用已经成为中学生的一项基本技能,掌握结构,科学使用,良好维护,使之成为广大青少年探索未来世界的一个窗口。  

光学显微镜的调试

一、显微镜照明光路系统的调整:

为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明,在显微镜初次安装和调试时,就必须把照明光路系统调整好,这是正确使用显微镜,并获得正确、可*结果的重要手段和最基本的要求。此外,正确掌握照明光路系统的调整,是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤,也是在日常使用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段。显微镜照明光路系统的调整主要有以下4项内容:

1、照明光源灯室在显微外的初步调整

① 首先将灯室的外壳打开,压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中,安装时避免手指直接接触灯泡(可用柔软的布或纸隔住),以免灯泡上留有指纹等脏物,影响灯泡的使用寿命。

② 把灯室摆在桌面上,接通电源后,用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔(标有“←→”),使灯丝投影在1-2m外的墙上,将灯丝成像调至清晰;然后调节灯的高低位置调节丝孔(标有“──”),使灯丝位置高低适当;再调节灯的左右位置调节螺丝孔(标有“──”),使灯丝左右位置合适。

2、光源发光体(灯丝)在显微镜内位置的检验和校正 目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内,从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明,这是调整库勒照明系统的前提条件。需要的基本工具:对中望远镜购置显微镜时已配备。

① 拔掉灯库内的毛玻璃套筒,把灯室装回显微镜上;

② 选用10×物镜,开亮光源程序找样品并调焦清晰,再换用40×物镜把样品调焦清晰(40×物镜可以看清灯丝的全貌);

③ 把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大;

④ 拔掉其中一个目镜,换上对中望远镜,抓住白色部分,另一手伸缩黑色接目镜,就可在视野中看到灯丝像;

⑤ 如灯丝位置不合适,调“──”孔,把灯丝像沿水平方向调好,调“──”孔,把丝像沿垂直方向调好,直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像;

⑥ 调整完毕后,将毛玻璃套筒插回原位,拔掉对中望远镜,换回目镜作下一步调整。以上所述照明光源灯室在显微镜外的调整和光源发光体在显微镜内位置的校验,只需在显微镜初次安装调试及更换灯泡时进行,平时使用显微镜时不能随意乱调乱动。万一调乱时,可按上述步骤调回原状。

3、库勒照明(Kohler)系统的正确调整 显微镜的正确调试,主要工作之一是照明光路系统的调整,而其中的关键是库勒照明系统的调整。对于每一位使用显微镜的人员,特别是作显微照像的人员来说,应该对库勒照明系统的原理及其调整步骤有一定的了解和掌握,才能充分发挥显微镜应有的功能,拍出来的照片才能在效果上比较一致而又完善。库勒照明系统的原理简单来说就是:光源发光体上任意一点发出的光,可以照明显微镜的视域范围,而光源发光体上每一点所发出的光汇集起来,在显微镜的视域中就实现了非常充分而又均匀的照明。调整库勒照明系统的目的,是为了使所观察的视域能获得均匀而又充分的照明,防止杂散光对照像系统造成影响或干扰,以免照像时在底片形成灰雾。高调整库勒照明系统的必要部件:视场光阑、可进行合轴调整的聚光镜系统。

① 选用10×物镜和10×目镜;

② 把聚光镜前端透镜摆进光路中,孔径光阑调至适中的位置上(不大不小),再把聚光镜升到最顶的位置上,聚光镜转盘调至明视野“J”位置;

③ 把视场光阑调至最小(0.1);

④ 载物台上放上已封片的生物样品,开亮光源,调焦清晰;

⑤ 视域中会出现一个局部照明的区域或亮斑,这是视场光阑的模糊像,在其中可以清晰地看到样品的细节;在它之外是较暗的视域,不一定能把样品的细节看得清楚;

⑥ 把聚光镜微微地向下调,使视野中的亮斑逐渐收小,慢慢变成一个清晰的多边形象,这便是视场光阑的清晰像;

⑦ 一般情况下,多边形象并不在视域中央,需要调整聚光镜的一对调中螺丝,把视场光阑多边形的像调至中央位置;

⑧ 逐渐开大视场光阑,使多边形象成为视域的内接多边形,进一步核对调中的状况,如对中不够理想,继续微微调对中螺丝;

⑨ 将视场光阑稍为再微微开大一些,使它的多边形象恰好消失在视域的边缘上,至此,库勒照明系统调整完毕。库勒照明系统调整好以后,整个视域照明均匀,拍摄的显微照片明亮清晰,反差正常。在日后使用过程中应特别注意: a. 视场光阑不可任意开大,但可随物镜倍数的增大而将视场光阑收小,随物镜倍数的减小而开大; b. 聚光镜的高低位置不准乱调,否则会破坏已调整好的库勒照明系统; c. 使用10×以下物镜时要将聚光镜前端透镜摆出光路外,使用10×或10×以上物镜时要将前端透镜摆入光路中; d. 关于物镜倍数与视场光阑大小配合问题,在实际使用过程中,作为一般观察不一定要收小或开大视场光阑,但作显微照相时,为了避免杂散光线对照相系统的干扰,以便能拍摄到较完善的照片,则应在使用每一个倍数的物镜时,把视场光阑调节到正好消失于所观察的视域边上,这是比较繁复的工作,但又非做不可。较为简便的方法是把与各个倍数物镜相对应的视场光阑事先调整好,并作好记号,以后使用时根据记号直接调至相应的位置。

4、孔径光阑的正确使用 由于聚光镜的孔径光阑可以影响显微镜的分辨率,使用时应掌握正确的使用方法。过去由于对孔径光阑的认识不足,往往把它当作是调节视野亮度的工具。虽然调节孔径光阑在一定程度上可以改变视野的亮度,但会直接影响成像的反差、对比度及分辨率,在使用过程中应尽可能避免。为了发挥聚光镜孔径光阑的作用,以便在观察时,尤其在作显微照相时获得最佳分辨率,在每换用一个倍数的物镜时,在样品调焦清晰后,需要调节孔径光阑,使它的大小正好等于所用物镜数值孔径(物镜孔径像)的2/3 。 调整方法是用对中望远镜对焦于视野中黑色相差环上,调节孔径光阑,可以看到一个边形的孔径光阑像,然后调到等于物镜孔径像的2/3,即介于黑色相差环外与圆形视域内之间。为方便起见,可把与各倍数物镜相对应的孔径光阑预先调整好,并作好标记,以免每次使用都要重新调整。

二、显微镜成像光路系统的调整及显微镜检术概要:

显微镜成像光路系统的调整,是根据不同显微镜检术的需要而进行的。所谓显微镜检术(microscopy),概括而言就是以显微镜观察样品时所使用的照明方法,以及如何使样品所成的像能获得更良好反差的技术与方法。以下简述显微镜检术中已成熟的几种方法及对应的显微镜成像光路系统的调整方法。

1、透射光明视野:

这是自显微镜发明以来最传统、最普遍的应用方法。基本部件: a. 物镜:任何物镜都可作明视野观察; b. 聚光镜:各种聚光镜均可,最好配有孔径光阑。调整方法:在上述显微镜的库勒照明系统调整好后,即可应用明视野法。适用范围:所有已染色的组织切片血液涂片等。注意事项: a. 使用明视野方法观察时,一定要将库勒照明系统调整好; b. 视场光阑不可任意开大,使用10×、10×以下和10×以上物镜时,要将聚光镜前端透镜分别摆事实出和摆进光路中; c. 不可用聚光镜的孔径光阑来调节视野的亮度,更不要乱调聚光镜的高低位置,否则,会降低显微镜的分辨率和破坏已调整好的库勒照明系统; d. 作显微照相时,每换用一个倍数的物镜,就要调节聚光镜的孔径光阑,使它的大小正好等于所用物镜数值孔径的2/3 。

2、透射光相差法:

这是现代显微镜检术中的一种反差增强法。基本部件:相差物镜、明视野与相差兼用的多用途聚光镜、对中望远镜、绿色滤光片。

调整方法:

a. 在库勒照明系统调整好的基础上,用明视野方法把样品调焦清晰;

b. 把聚光镜转到Ph1对准转盘刻度线位置,选用10×相差物镜,换上待观察的透明样品;

c. 拔掉其中一个目镜,换上对中望远镜,并调焦于视野中的两个相差环上(物镜的黑色相差环和聚光镜的透光相差环);

d. 视野中的两个相差环不一定重合,调节聚光镜上的两个调节装置(调整相差环左右位置的调节杆和调整前后位置的摩擦式转钮),使透光环作前后左右移动而与黑环重合;

e. 调整好后,换回观察用目镜,将绿色滤光片按入光路中,即可观察到样品的相差像;

f. 有20×和40×物镜观察时,聚光镜应设在Ph2位置上,用100物镜时,聚光镜应设在Ph3位置上。

适用范围:适用于观察透明、未染色或不能染色的样品,如各种细胞、活组织、未染色或不染色的组织切片、水生生物等。

3、微分干涉相衬法:

为了克服相差法观察时样品细节像周围伴随有光晕,会掩没掉本来应该看见的细节,以及样品或组织切片厚度要求相当薄,原则上下能厚于10?m等局限性,利用双光束干涉的原理设计子微分干涉相衬法。

调整方法:

a. 必须在库勒明系统已调好的基础上才能调好DIC方法;

b. 先用10×物镜,以明视野先确定好能把样品看清晰的物镜调焦位置;

c. 把起偏器(polarizer)摆入照明光路中,注意其取向应为东—西方向;

d. 把聚光镜转盘转到与10×物镜对应使用的位置上,即DIC 0.3—0.4;

e. 在物镜后方或物镜转换器上插入10×物镜使用的DIC插片(DIC slider);

f. 把检偏器(analyser)插入成像光路中,注意其取向应为南—北方;

g. 换上待观察的透明样品,开亮光源把样品调焦清晰;

h. 调节DIC插片,使微分干涉相衬的像达到最佳效果,也就是浮雕效果最为明显;

i. 同时可调节聚光镜的孔径光阑,使反差的效果也达到最佳;

j. 然后再细微调样品的细节,可见样品中不同层面上的结构;

k. 如果把补色器(first order red retardation plate)插入,并同时调节DIC插片,可在视野中看到不断变化的绚丽色彩,红、橙、黄、绿、蓝、紫、粉红、粉紫及金黄色都具有。适用范围:透明或不能染色的组织切片,厚度可达100?m左右,培养中的活组织和活细胞、小生生物等。

4、落射光激发的荧光法(incident-loght fluorescence Epi-FL):

简称为落射荧光法,是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方,光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品,从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察。该方法较简便,效率高,50W的光源强度比透射荧光法的250W还强。荧光方法是利用波长较短的紫外光、紫光、蓝紫光、蓝光及绿光等去激发样品,只要样品中含有可产生荧光的成分,它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光。不同物质只能吸改特定波长的激发光,而释放的荧光也会有特定的波长,因而用作特异性的鉴定十分有效,如某些致病的细菌和螺旋体,受紫外光激发后能发出它们特有的荧光,很容易作出鉴定,这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法。某些物质自身不会吸收激发光,或吸收后不能释放荧光,但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料,而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光,再释放出特定的荧光,从而间接地鉴别出某种物质,这称为间接荧光法。上述荧光方法广泛应用于医学、生物学及工业的特异性研究和鉴别上。调整方法:荧光显微镜或附有荧光部件的显微镜,调整的方法大致相同。

① 汞灯的安装:

a. 打开包装,取出汞灯将其小心安装在上电极散热帽上,安装时注意手指不能直接接触灯管和散热帽的正面,汞灯的封气口要对向散热帽的左侧或右侧;

b. 把汞灯的上电极引张安装并固定在散热帽底面的小孔上,再把汞灯的下电极及上电极引线另一端,分别安装在灯座上各自的插孔中并固定;

c. 锁紧散热片上的螺丝后,把汞灯连同灯座及散热帽小心装入灯室中,锁紧相应的螺丝,再把灯座上的连线和插座插到汞灯电源后部专用的插座上。

d. 详细的安装方法请参照有关说明书。

② 汞灯灯室在显微镜外的初步调整:

a. 接通汞灯电源,让汞灯预热10-15min;

b. 把汞灯灯室摆放在桌面上,让汞弧投影到2-3m外的墙上,划一条与灯室窗口中心线对地高度一样的水平线作为参考线;

c. 转动灯室调焦旋钮,使汞弧的像清晰地投影于墙上;

d. 分别调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔,把汞弧的像其反射像调成并排且尽量*近,但不要重叠在一起。

③ 汞灯汞弧在显微镜内位置的检验:

a. 将汞灯照明光路系统中的视场光阑开到最大;

b. 把荧光滤光片组推到蓝光激发的位置上,以避免汞灯中的蓝光太刺眼;

c. 把观察的样品或一块载玻片放在物台上,盖上一张比盖玻片稍大且洁白的薄纸;

d. 取下一个物镜,使激发的蓝光经物镜转换器的空档照在白纸上,白纸上会有一蓝色的圆形照明区域,汞弧的像及其反射像都应该出现在这区域的中央部位,否则,可调节灯室调焦旋钮至最清晰,然后分别调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔,直至汞弧的像及其反射像并排在照明区域的中央位置。

e. 调好之后,把物镜装回去,通过目镜可见白纸被蓝光激发后发射出的黄绿色荧光;

f. 仔细调焦,可看清白纸的纤维;取去白纸,样品上的荧光细节隐约可见而很容易调焦清晰。

④ 汞灯使用注意事项 目前通常使用的为50W超高气压汞灯,灯管内通有一对钨电极和液态汞(室温下附在管壁上),未点燃时,管内气压很低,在灯管的两电极间施加电压角发点燃后,汞气化为汞蒸气形成汞弧而产生强光,温度升高,管内气压迅速升到10个大气压。由于是高气压的气体放电,必须了解其特性才能安全地使用汞灯。

a. 汞灯接通电源后需要10-15min预热时间,汞才能充分汽化并形成汞弧,产生高亮度而稳定的激发光。因此,观察前要提早通电;

b. 汞灯在使用过程中,不要随意开关汞灯的电源;

c. 关掉汞灯电源后,必须等待15-20min,待汞灯自燃冷却后才可再次接通电源,违反这一操作规定时,将会造成严重后果!由于汞灯内的汞蒸气未完全液化,汞蒸气内阻很小,一旦通电在两电极间施加电压,汞灯内形成强大的电流,轻则烧断保险丝或烧毁汞灯电源中的扼流圈,重则汞灯爆炸,汞蒸气弥漫整个实验室,造成工作人员中毒,不仅损失了汞灯,还会炸毁灯室内的集光-聚光部件。

d. 汞灯的使用寿命一般只有300h,使用得当可达600h,使用寿命与开关的次数成反比,应集中一批样吕作2-3h的观察。汞灯价格及昂贵,应珍惜使用。

e. 汞灯寿命终结的标志是点燃困难,灯管发黑。

5、暗视野法(dark field):

许多透明或半透明的样品,如细菌、微生物、细胞内的精细结构及结晶体的内含物等,在明视野显微镜中不容易看清楚,如果采用暗视野法就可以大大提高样品的可视度。以暗视野法所看到的是衬托在黑暗视野背景中发亮的样品轮廓及其细节。普遍光学显微镜的最高分辨率为0.2μm,而暗视野显微镜虽然对样品的细节构造分辨不清楚,但却可看到0.004μm以上微细颗粒的存在,即可以看到亚显微结构,特别适合用来观察微细的颗粒与细菌等。调整方法:暗视野法的主要必需部件是暗视野聚光镜。使用时须先用明视野聚光镜把库勒照明系统调整好。换上暗视野聚光镜时,要把载玻片(样品)移开,将浸没油滴在聚光镜顶部,再把样品载玻片搁在物台上,浸没油便充填在两者之间,这种聚光镜须与装有可变光阑的100×油镜配用。另一种中倍率干式暗视野聚光镜可与中倍率的物镜配用,这种聚光镜具有中央光挡,照明光只能透过光档与聚光镜边缘之间的透光环才能进入聚光镜内。对于配备齐全的相差显微镜,与编号为Ph3物镜配用的相差聚光镜相差环,可以和 10×及10×以下的相差物镜配用而形成低倍率的暗视野效果。

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