核小体

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核小体的形状类似一个扁平的碟子或一个圆柱体,直径为11nm,高6nm。染色质就是由一连串的核小体所组成。当一连串核小体呈螺旋状排列构成纤丝状时,DNA的压缩包装比约为40。纤丝本身再进一步压缩后,成为常染色质的状态时,DNA的压缩包装比约为1000。有丝分裂时染色质进一步压缩为染色体,压缩包装比高达10000,即只有伸展状态时长度的万分之一。

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目录

定义

核小体是染色体的基本结构单位,由DNA和组蛋白(histone)构成,是染色质(染色体)的基本结构单位。由4种组蛋白H2A、H2B、H3和H4, 每一种组蛋白各二个分子,形成一个组蛋白八聚体,约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面,形成了一个核小体。这时染色质的压缩包装 比(packing ratio)为6左右,即DNA由伸展状态压缩了近6倍。200 bpDNA为平均长度;不同组织、不同类型的细胞,以及同一细胞里染色体的不同区段中,盘绕在组蛋白八聚体核心外面的DNA长度是不同的。如真菌的可以短到只有154 bp,而海胆精子的可以长达260bp,但一般的变动范围在180bp到200bp之间。在这 200bp中,146 bp是直接盘绕在组蛋白八聚体核心外面,这些DNA不易被核酸酶消化,其余的DNA是用于连接下一个核小体。连接相邻2个核小体的DNA分子上结合了另一种组蛋白H1。组蛋白H1包含了一组密切相关的蛋白质,其数量相当于核心组蛋白的一半,所以很容易从染色质中抽提出来。所有的H1被除去后 也不会影响到核小体的结构,这表明H1是位于蛋白质核心之外的。  

形状

核小体

核小体的形状类似一个扁平的碟子或一个圆柱体,直径为11 nm,高6 nm。染色质就是由一连串的核小体所组成。当一连串核小体呈螺旋状排列构成纤丝状时,DNA的压缩包装比约为40。纤丝本身再进一步压缩后,成为常染色质的状态时,DNA的压缩包装比约为1000。有丝分裂时染色质进一步压缩为染色体,压缩包装比高达10 000,即只有伸展状态时长度的万分之一。  

染色体

染色体是一个独立行动的结构单位,在细胞分裂时传递给子细胞一份染色体拷贝。因此每条染色体必须能复制,所复制的拷贝最后分离并被正确地分配到两个子细胞中。这些基本功能是由真核生物染色体三种特定的DNA序列所控制,即DNA复制起点着丝粒端粒

从DNA到染色体不论是形态还是长度都相差很大。人类最长的第一个染色体全长仅10mm,但其DNA却长达7.2cm;一个细胞核直径仅5nm,在这样一个小小的空间中却要纳下全长近200cm的DNA,人们不禁要问DNA如何形成染色体,纳入小小的核中。解决这个问题同样是由很多科学家差不多经过20年的努力,最终提出了为大多数能接受的模型¾侧环模型。  

实验

核小体

早在1956年为双螺旋模型提供X衍射证据的Wilkins和另一位科学家Vittorio Luzzati对染色质进行了X衍射研究,发现染色质中具有间隔为100Å的重复性结构。蛋白质和DNA本身的结构从来不会表现出这种重复性。推测可能是组蛋白和DNA的结合方式迫使DNA折叠或缠绕成具有100Å周期的重复结构。

Clark和Felsenfeld于1971年首先用葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease)来作用染色质,发现有一些区域对核酸酶敏感,有一些则不敏感,不敏感的区域比较均一,这暗示染色体中存在着某些亚单位。接着Hewish和Burgoyun(1973年)用内源核酸酶消化细胞核,再从核中分离出DNA,结果发现一系列DNA片段,它们相当于长约200bp的一种基本单位的多聚体。表明组蛋白结合在DNA,以一种有规律的方式分布,以致产生对核酸酶敏感的只是某些限定区域。M.Noll(1974年)用外源核酸酶处理染色质,然后进行电泳,证实了以上结果,他测得前三个片段的长度分别为205,405,605bp长,每个片段相差200bp,即染色质可能以200bp为一个单位。这正好和以下电镜观察的结果相映证。

与此同时Olins夫妇(1974)和Pierre Chambon等(1975)在电镜下观察到大鼠胸腺鸡肝染色质的“绳珠”状结构,小球的直径为100 Å,Olins并把这种小球称为n小体(n-body即nu body),有时译成钮体。

X衍射图表明组蛋白的多聚体都是紧密相联,并无可容纳像DNA分子那样大小的孔洞,所以不可能由DNA之“绳”穿过组蛋白之“珠”,而只可能是DNA缠绕在“珠”的表面。

电泳的结果和电镜观察到“绳珠”结构之间是什么样的关系呢?Kornberg和Thomas 1974年用实验回答了这一问题。他们先用小球菌核酸酶稍稍消化一下染色质,切断一部分200核苷酸对单位之间的DNA,使其中含有单体、二聚体三聚体和四聚体等。然后经离心将它们分开。每一组再通过凝胶电泳证明其分子大小及纯度。然后分别用电镜来观察各组的材料;结果单体均为一个Å 的小体,二聚体则是两个相联的小体,同样三聚体和四聚体分别由三个小体和四个小体组成,表明200核苷酸的电泳片段长度级差正好是电镜观察到的一个:“绳珠”单位,他们称其为核小体(nucleosome)或核粒,提出了染色质结构的“绳珠”模型。  

原理

人们接着用化学交联、高盐分离组蛋白,以及X衍射等方法进一步研究组蛋白多聚体的结构、排列以及怎样和DNA结合的,从而建立了核小体模型。1984年Klug和Butler进行了修正。核小体的构造可用图表示:

核小体

每一个核小体结合的DNA总量为200bp左右,一般在150~250变化范围(micrococcal nuclease)轻微消解染色质而得知的。连接两个核小体的连接DNA (linker DNA) 是最容易受到这种酶的作用,因此微球菌核酸酶在连接DNA处被切断,此时每个重复单位的DNA长约200bp,而且是和五种组蛋白相结合,保持着核小体的结构。也就是“绳珠”结构的绳被切断,剩下一个一个的“珠”。  

基本单位

核小体是染色体的基本单位。  

抗核小体抗体(AnuA)

核小体是细胞染色质中的一种成分,它是由DNA和组蛋白以特殊的方式相连而组成的。在系统性红斑狼疮的诱导和致病中有重要作用。

临床意义:抗核小体抗体比抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体更早出现于系统性红斑狼疮的早期,并且特异性较高。阳性率为50-90%,特异性>98%。

核小体

每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1;组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构;146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈, 组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA,锁住核小体DNA的进出端,起稳定核小体的作用。 包括组蛋白H1和166bp DNA的核小体结构又称染色质小体;两个相邻核小体之间以连接DNA相连,典型长度60bp,不同物种变化值为0~80bp;组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的,基本不依赖于核苷酸的特异序列,实验表明,核小体具有自组装 (self-assemble) 的性质;核小体沿DNA的定位受不同因素的影响,进而通过核小体相位改变影响基因表达。:

其功能与染色质的浓缩有关,且能够进行自装配。  

注意事项

AnuA被定义为与组织蛋白暴露在染色质的部分发生反应的抗体,在染色质内找到的DNA结构,或者一个由天然组织蛋白DNA复合物构成的表位,特别要排除的是抗体与非组织蛋白的反应和隐藏在染色质内的组织蛋白表位的反应,以及与DNA结构如A、C以及Z构型的反应。这些在染色质中均不存在,因此,并不是所有组织蛋白和DNA活性的抗体都具有抗染色质活性。染色质作为ELISA中的抗原最有用的构型是脱H1染色质和核小体核心粒子。在这两种情况下,天然染色质通过微球菌核酸酶消化溶解,H1和非组织蛋白被除去,再用0.5M生理盐水在中性pH条件下而得染色质。核小体核心粒子由包裹在天然组织蛋白(H2A、H2B、H3、H4)八聚体DNA组成。多元核小体核心粒子,DNA链未被核酸酶切断时,叫做H1修饰染色质。人们开始重新关注AnuA。AnuA是首批被发现的自身抗体之一,因为它们是组成引起红斑狼疮的细胞排列构造的大多数抗体。许多研究资料表明了这种抗体辅助诊断系统性红斑狼疮和药物引起的狼疮(DIL)的临床应用,并且从某种意义上来说,AnuA的定量曾是在临床实验室所进行的最普遍的免疫学实验之一。AnuA在过去的10年里曾有过许多的名字:红斑狼疮因子、抗核小体、抗DNP以及抗(H2AH2BDNA),这些自身抗体可在近乎75%的系统性红斑狼疮患者身上找到,并且有达100%的患者是由药物引起的,它们也可在20%~50%的1型自身免疫肝炎患者身上找到。  

临床意义

核小体

在80%的MRL/lprDIL小鼠中可产生核小体特异性抗体,该自身抗体产生早,先于其他抗核抗体,与肾小球肾炎有关。SLE患者多克隆核小体特异性自身抗体的抗原反应与鼠类SLE模型表现相似,核小体在SLE中作为主要自身抗原近年已得到证实。靶器官免疫复合物的沉积和炎性介质(包括补体)的大量活化是引起SLE全身性组织炎症损伤的基本机制之一。核小体会成为多克隆B细胞活化剂,这可能与SLE疾病的起始阶段有关;但更重要的是,核小体是SLE中致病性T辅助细胞识别的自身抗原,不仅引起同源B细胞产生核小体特异性自身抗体,而且引起抗DNA抗体和抗组蛋白抗体的形成。AnuA在抗dsDNA阴性的SLE患者中有很高的阳性率(可达60%~65%)[8,16],因此AnuA对SLE患者更具有诊断价值。最近有证据表明,除了传统的致病性抗双链DNA抗体及其抗原抗体复合物外,核小体和组蛋白成分的自身抗体及其抗原抗体复合物,在SLE的发病机制中起关键作用,尤其是在DIL肾炎致病机制上意义重大[6]。核小体的组蛋白成分(氨基末端带强阳性电荷)可促进免疫复合物与肾小球基底膜阴离子位点的结合,包括既作为植入抗原使原位免疫复合物得以形成,也可使含有核小体特异性抗体的循环免疫复合物得以沉积。在以上两种情况下,均可使肾小球基底膜的通透性增加,且产生炎性免疫应答反应。钟清等[7]研究表明,LN组患者AnuA阳性率明显高于无肾炎组,AnuA对LN的诊断和监测具有重要意义。此外,苏茵等[8]也发现AnuA与患者的皮疹脱发、ESR增快、CRP增高、补体降低呈显著相关性,其滴度高低也与SLE疾病活动指数评分呈明显正相关。  

特性

有两项关于AnuA重要评论表明这种抗体对SLE和DIL具有敏感性和特异性,并且AnuA的存在通常在SLE与肾小球肾炎患者中相联系。AnuA较抗DNA具有更高的敏感性。如果阴阳性分割点升高,能使抗核小体对狼疮更加敏感。近年来,由于核小体抗原纯化技术的改进,提高了AnuA对SLE患者的诊断特异性。研究结果表明,应用ELISA方法检测AnuA在SLE患者中具有很高的敏感性和特异性。国外报道,对SLE患者进行AnuA检测,起敏感性和特异性分别为56.0%~64.2%和97.0%~98.8%,国内苏茵等提出,AnuA可出现于SLE疾病进程的各个时期,对SLE的敏感性高(69.9%)、特异性强(97.9%),可能是SLE的标记抗体之一,但许苛等,报道测定敏感性偏低(55.8%)、特异性偏低(95.3%)。考虑与AnuA的来源不同、检测人群和疾病活动度不同以及所用实际不同有关,但是与dsDNA抗体、抗Sm抗体比较,敏感性均有了较大的提高,且有良好的特异性,可用于SLE的诊断,多种商品化检测试剂盒的出现,使该自身抗体应用于临床SLE等结缔组织病的诊断和鉴别诊断成为可能。  

检测技术

许多不同的技术已被用于检测AnuA,除了LE细胞试验以外,还有染色质包被的串珠乳胶凝集试验,以及免疫沉淀(用天然组织蛋白重组酸萃取的组织部分和ELISA法都已被使用。早期的研究用“脱氧核苷蛋白”作抗原研制出一种孵育在1M生理盐水中的染色质中的预备品,但未得到明确鉴定。后期报道已有更好的方法来鉴定该预备品,并能分析凝胶电泳后的蛋白质和DNA的组成。染色质的类型分析以及阴、阳性判断对于辅助诊断SLE患者而获取高敏感性和特异性是非常重要的。第一种研究用于以变性的H2A和H2B作为抗原进行DNA再造,由血清结合上组织蛋白的变性区域,即天然染色质非暴露部分;第二种研究用于整条染色质作为抗原,剩余的Scl70蛋白引起抗Scl70,血清在此情况下产生弱阳性;第三种研究用于一个阴、阳性的弱的(低的)判断(硬皮患者血清呈现弱阳性)。

核小体

第一代与第二代核小体检测技术的比较通过对SLE组(96例)、患者对照组(73例)、正常对照组(47例)进行AnuA和抗dsDNA抗体的检测,采用由德国EUROIMMUN公司生产的试剂盒和美国Coda公司生产的全自动酶标分析仪检测。结果表明,EUROIMMUN推出的第二代抗核小体抗体ELISA检测试剂与第一代比较敏感度差异不大,但特异性却有了明显提高。早期因核小体抗原纯化制备方法存在技术上的问题,纯化的核小体抗原常含有H1、Scl70(DNA拓扑异构酶I,一种DNA结合蛋白)、残留的染色质DNA和其他非组蛋白等蛋白成分,导致多种结缔组织病患者血清与核小体抗原交叉反应,尤其是在10%~68%的硬皮病患者中也可检测出AnuA,使得该抗体作为SLE特异性抗体的临床应用价值得到了很大的限制;而第二代AnuAELISA试剂在抗原的制备上有了很大的改进,抗原分离纯化技术提高,纯化的核小体抗原制品只含核小体单体,不含以上提到的DNA和组蛋白等杂质成分,可排除硬皮病患者血清假阳性反应,这样就使得AnuA对SLE的诊断价值得到了充分的发挥,极大提高了AnuA对SLE的特异性,目前已开始应用于临床常规检测。  

研究新进展

目前,国内已有少数医院开展了AnuA的检测,也已发表了数篇相关报道。有文献报道,以核小体多肽特异性抗原治疗鼠狼疮模型的研究发现,核小体多肽特异性抗原可以抑制TH细胞和B细胞的激活,从而为研究SLE的发病机制治疗带来了新的曙光[20]。但需要指出的是:AnuA的检测对SLE的诊断有重要意义,不同的核小体来源、不同的检测人群和疾病活动度、以及检测试剂、方法等均会带来结果差异。该抗体与抗Sm抗体不同,并非是SLE标记抗体。虽然已发现AnuA对诊断SLE的敏感性和特异性比抗dsDNA抗体高,但仍有不完全一致的结果。我国的情况如何还应进行大样本、多中心检测从而得到更合理、更准确的结论。SLE的诊断不能仅凭某一种抗体阳性与否加以肯定或否定,在建立该抗体检测前首先要明确其临床意义,其次,要避免假阳性或假阴性结果,如同其他自身抗体的检测一样,临床医师在诊治工作中必须密切结合患者的临床资料,正确看待检测结果,切勿以实验室检查代替一切。


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